用于检测OCT4蛋白的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医疗检测领域，具体涉及一种用于OCT4蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板；(2)OCT4蛋白系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测OCT4蛋白的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
前列腺癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，其中约70％为非肌层浸润性肿瘤，治疗后5-15年内复发率高达60-85％，其中20％可进展为浸润性肿瘤。非浸润性前列腺癌易复发易进展，及早发现前列腺癌及复发肿瘤十分重要。目前临床上主要的检测手段为镜检查及尿脱落细胞学检测，但是镜检查创伤性大且检测费用昂贵，而尿脱落细胞学检测的敏感性较低。因此人们将研究重点置于癌的分子生物学研究，希望从分子水平上揭示癌的发生、发展、转移及转归，提高癌的诊治水平。八聚体转录因子4(octamer-bindingtranscriptionfactor4，OCT4)是一种在早期胚胎细胞中特异性表达的核转录因子，被认为是干细胞分化全能性的标记，参与干细胞的自我更新。OCT4在多种体细胞肿瘤组织中有过表达，OCT4相对分子质量为18000，属于POU核转录因子家族，其特征是特异性结合靶基因启动子中的核苷酸八聚体序列，从而启动基因表达。在正常发育过程中，OCT4蛋白在囊胚阶段的全能干细胞、内细胞群的多能干细胞中表达，随着胚胎干细胞的分化，OCT4基因在滋养层外胚层和原始内胚层中表达不断下调，在已分化成熟的细胞中不表达。关于OCT4蛋白最早的研究主要集中在胚胎和生殖细胞肿瘤，近几年越来越多的研究发现在非生殖系统肿瘤细胞和组织中，胰腺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌细胞株和组织中也检测到OCT4蛋白的表达，这被认为是细胞癌变过程中肿瘤干细胞致癌的一种证据。国内外对于OCT4蛋白与癌的研究结果显示OCT4蛋白在瘤组织中高表达，而且随着肿瘤分级的增加，OCT4蛋白的阳性表达率也明显升高。OCT4蛋白检测有助于早期发现前列腺癌肿瘤，并可用来判断肿瘤的恶性分化程度及检测患者术后的复发情况。美国FDA已批准将八聚体结合转录因子4(OCT4)检测作为50岁以上男性的普查指标。使用总OCT4作为诊断前列腺癌的诊断标准是：八聚体结合转录因子4(OCT4)：0～5ng/ml正常；5～20ng/mL，21～25％的患癌几率；>20ng/ml癌症。在5.0～20ng/ml的灰色区域。2004年底，中国60岁及以上老年人口为1.43亿，预测2051年达最大值，之后一直维持在3亿～4亿的规模。据文献报道10％的老年男性八聚体结合转录因子4(OCT4)为5～20ng/mL，这些患者需要进一步检查以排除前列腺癌，即700万人/年有可能检测八聚体结合转录因子4(OCT4)。
技术实现思路
本专利技术的第一方面是提供一种OCT4蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板；(2)OCT4蛋白系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。所述OCT4蛋白系列标准品的OCT4蛋白含量为：0、2、4、8、16和32μg/L的50mmol/LPBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有1gBSA和5g蔗糖。所述酶标记抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的抗OCT4抗体、0.1mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.1mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.5。所述稀释液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；所述洗涤液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。所述底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；所述显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；所述终止液为3mol/L硫酸。本专利技术的第二方面是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：(1)包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板的制备：a、抗体稀释:用pH为8.5的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗OCT4蛋白单克隆抗体稀释到30～40μg/ml，得包被液；b、包被:取微孔板，用洗涤液洗涤3次，加入上述含抗OCT4蛋白单克隆抗体的包被液，每孔100μL/孔，4℃孵育12小时；C、封闭:倾去包被液，置于吸水纸上轻拍几次，去除残液，加入含重量百分比为0.1％的甘油单蓖麻油酸酯、0.5％的BSA和1％蔗糖的浓度为50mmol/L的Tris-HCl封闭液，其pH为8.0，300μl/孔，室温，1小时；d、真空干燥，密封，即得包被有抗OCT4抗体的酶标板。(2)酶标记抗体溶液制备：a,将10mgHRP(辣根过氧化物酶)溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml,混匀于4℃放置30分钟；b，加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；c,加入含5mg抗OCT4抗体的水溶液2ml,然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；d，吸出透析袋内溶液，加入0.5mlNaBH4,4℃下放置2小时；e，滴加等体积饱和(NH4)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；f，上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.02mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；g,吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过Superose6层析柱，用0.02mol/LpH7.4的PBS洗脱，收集第一峰，即为纯化的酶标记抗体；h，将收集的酶标记抗体除菌过滤，再用含0.1mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.1mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。(3)稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液，按照本领域常规的溶液配制方法制备。本专利技术发现对于OCT4蛋白的ELISA检测试剂盒来讲，酶标抗体及酶标板的稳定性较差，即使在4℃下保存稳定性也仅为6-8个月，这也是OCT4蛋白ELISA试剂盒在临床应用较少的一个重要原因。本专利技术通过调整封闭液组成以及酶标抗体的稳定剂大幅提高了ELISA试剂盒稳定性，在常温下可保存12个月以上，4℃可保存36个月以上。具体实施方式下面将进一步的来举例说明本专利技术。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1(1)包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板的制备：a、抗体稀释:用pH为8.5的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗OCT4蛋白单克隆抗体稀释到35μg/ml，得包被液；b、包被:取微孔板，用洗涤液洗涤3次，加入上述含抗OCT4蛋白单克隆抗体的包被液，每孔100μL/孔，4℃孵育12小时；c、封闭:倾去包被液，置于吸水纸上轻拍几次，去除残液，加入含0.1％的甘油单蓖麻油酸酯、0.5％的BSA和1％蔗糖的浓度为50mmol/L的Tris-HCl封闭液，其pH为8.0，300μl/孔，室温，1小时；d、真空干燥，密封，即得包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板。(2)酶标记抗体溶液制备：a,将10mgHRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml,混匀于4℃放置30分钟；b，加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种OCT4蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板；(2)OCT4蛋白系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。

【技术特征摘要】
1.一种OCT4蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1)包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板；(2)OCT4蛋白系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述OCT4蛋白系列标准品的OCT4蛋白含量为：0、2、4、8、16和32μg/L的50mmol/LPBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有1gBSA和5g蔗糖。3.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的抗OCT4抗体、0.1mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.1mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.5。4.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；所述洗涤液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。5.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠。6.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；所述终止液为3mol/L硫酸。7.一种权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：(1)包被有抗OCT4蛋白抗体的酶标板的制备：a、抗体稀释:用pH为8.5的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗OCT4蛋白单克隆抗体稀释到30...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44