经修饰的自然杀伤细胞及其用途制造技术

本发明专利技术在某些方面提供了表达白介素‑15(IL‑15)的全部或功能部分的自然杀伤(NK)细胞，以及用于产生这样的细胞的方法。本发明专利技术还提供了使用表达白介素‑15(IL‑15)的全部或功能部分的自然杀伤(NK)细胞来治疗对象中的癌症或者增强NK细胞的扩增和/或存活的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求于2014年5月15日提交的美国临时申请No.61/993,494的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。
技术介绍
NK细胞在体内存活和增殖需要细胞因子(例如IL-2和IL-15)的刺激。例如，在对免疫缺陷小鼠进行注射后，活化的NK细胞在1周后变得不可检出，但如果还施用人IL-2，其持续长达一个月仍可检出。因此，使用NK细胞输注的临床方案通常依赖于IL-2施用来延长NK细胞在患者中的存活。然而，IL-2可具有相当大的副作用。除了发热和寒战以外，IL-2施用可导致更严重和可能致命的后果，例如毛细血管渗漏综合征(capillaryleaksyndrom)。降低IL-2的剂量应当降低副作用的风险，但是可导致刺激调节性T细胞，所述调节性T细胞可抑制NK细胞功能并且可能使其抗癌作用无效。因此，开发在体外和/或体内促进NK细胞扩增和活性的替代方式将是重要的。附图简述本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本。前述内容将由以下本专利技术的一些实例实施方案的更具体的描述而显而易见，如附图所示，在不同视图中相同的附图标记表示相同部件。附图不一定按比例绘制，而着重于示出本专利技术的一些实施方案。图1A-1C：IL-15构建体的设计和表达。1A.本研究中使用的野生型和膜结合IL-15构建体(“wtIL15”和“mbIL15”)的示意图。1B.用mbIL15转导的NK细胞表面之IL-15的表达。扩增的NK细胞用wtIL15、mbIL15或用仅含有GFP的载体(“模拟(Mock)”)转导。流式细胞术点图示出了如通过抗IL15抗体(R&DSystems)和与藻红蛋白(phycoerythrin)缀合的山羊抗小鼠二抗(SouthernBiotechnologyAssociates)检测到的GFP和IL-15的表达。示出了每个象限中的细胞百分比(＞98％CD56+CD3-NK细胞)。1C.用wtIL15转导的NK细胞的IL-15分泌。对来自3个不同供体的NK细胞一式三份地测试。条表示在无IL-2的情况下培养24和48小时后收集的上清液中进行的ELISA测量的平均值±SD。在模拟转导的细胞的上清液中未检测到IL-15。图2A-2C：表达IL-15的NK细胞在体外的存活和扩增。2A.与来自15个供体的模拟转导和mbIL15转导的细胞(左图)以及来自9个供体的mbIL15或wtIL15转导的细胞之无IL-2的7天平行培养后的输入细胞相比的NK细胞回收百分比。水平条表示中值。示出了成对t检验的结果。用IL-2(10和100IU/mL)培养的结果示于补充图S1中。2B.用低剂量IL-2(10IU/mL)的来自6个供体的模拟转导和mbIL15转导的NK细胞的存活和扩增。2C.来自一个供体的不用IL-2或用低剂量IL-2(100IU/mLIL2的结果示于图6中)培养的用mbIL15、wtIL15转导或模拟转导的NK细胞之扩增和长期存活。示出了在指定培养天数的NK细胞回收百分比。图3A-3C：表达mb-IL15的NK细胞在体内的存活和扩增。3A.在输注后7天和11天，注射了有或无IL-2的模拟转导或mbIL15转导的NK细胞的小鼠(总计16只小鼠)的外周血中人CD45+细胞的绝对数目(在第7天无IL-2的P＝0.004，有IL-2的P＝0.021；在第11天P＝0.044和0.026)。3B.流式细胞点图示出了不用IL-2处理(上部)和用IL-2处理(下部)的小鼠外周血中人CD45+、GFP+NK细胞的存在。示出了有或无GFP表达的人CD45+细胞的百分比。3C.在注射后第11天收集的注射了有或无IL-2的模拟转导或mbIL15转导的NK细胞的小鼠多种组织中人CD45+细胞的百分比。总体而言，mbIL15的人CD45+细胞的百分比显著较高(无IL-2的P＜0.001，有IL-2的P＝0.002)。图4A-4C：表达mbIL15的NK细胞的性质。4A.在用mbIL15转导或模拟转导的NK细胞群中培养7天之前和之后的GFP+细胞的相对比例。示出了来自13个供体的NK细胞的结果；对于mbIL15P＜0.001，对于模拟不显著。4B.mbIL15转导的NK细胞的免疫表型特征。通过流式细胞术对在无IL-2的情况下培养48小时的NK细胞进行细胞标志物分析。所有结果概述于表中。4C.将模拟转导和mbIL15转导的NK细胞在无IL-2的情况下培养48小时，并通过Kinex抗体微阵列(Kinexus)分析细胞裂解物。在测试的809个抗磷蛋白抗体中，示出了信号的Z比值＞0.5且误差范围％＜100的那些。条表示与模拟转导的NK细胞中的归一化强度相比表达mbIL15的NK细胞中的信号变化百分比。图5A-5D：表达mbIL15的NK细胞的抗肿瘤能力。5A.以1∶4和1∶1E∶T比例(在每种比例下进行15次实验；两种比例的P＜0.001)的来自9个供体的mbIL15和模拟转导的NK细胞抗Nalm-6、U937、K562、Daudi、SK-BR-3和ES8细胞系的24小时细胞毒性测定结果。在4小时和24小时细胞毒性测定中用单个细胞系获得的结果示于图7中。5B.表达mbIL15的NK细胞在靶细胞存在下释放裂解性颗粒提高。在以1∶1E∶T的4小时细胞毒性测定后CD107a+NK细胞的百分比。示出了来自3个供体的NK细胞抗2种细胞系的结果(P＝0.007)。5C.表达mbIL15的NK细胞在体内表现出抗肿瘤活性。向NOD-SCID-IL2RGnull小鼠i.p.注射1×104个用萤光素酶标记的U937细胞。在3只小鼠中，未进行处理(“无NK”)，而4只小鼠在第3天和第7天接受模拟转导的NK细胞(1×107i.p.)，并且另外4只小鼠以相同的剂量和方案接受mbIL15转导的NK细胞。示出了肿瘤生长的体内成像结果(腹部图像)。5D.不同处理组中小鼠的总体存活比较。当生物发光达到1×1011个光子/秒时，对小鼠实施安乐死。示出了3条曲线的对数秩检验的P值以及在2条曲线的每一条之间的比较。图6A-6C：表达IL-15的NK细胞在体外的存活和扩增。6A.在不存在IL-2的情况下表达mbIL15的NK细胞的扩增被抗IL-15中和抗体抑制。符号示出在用mbIL15转导的NK细胞的实验中与输入细胞相比培养期间的平均NK细胞回收(±SD；n＝3)。6B.与用低剂量(10IU/mL)和高剂量(100IU/mL)IL-2对来自6个供体的模拟转导、mbIL15转导和wtIL15转导的细胞进行7天平行培养后的输入细胞相比NK细胞回收的百分比。水平条表示中值。示出了成对t检验的结果。6C.来自一个供体的用mbIL15或wtIL15转导并用100IU/mLIL2培养的NK细胞的扩增和长期存活。示出了在指定培养天数的NK细胞回收百分比。图7A-7B：表达mbIL15的NK细胞的抗肿瘤能力。示出了以1∶4、1∶2和1∶1E∶T比例的mbIL15和模拟转导的NK细胞抗Naim-6、U937、K562、Daudi、SK-BR-3和ES8细胞系的4小时(7A)和24小时(7B)细胞毒性测定结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
自然杀伤(NK)细胞，其表达白介素‑15(IL‑15)的全部或功能部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.15 US 61/993,4941.自然杀伤(NK)细胞，其表达白介素-15(IL-15)的全部或功能部分。2.权利要求1所述的NK细胞，其中所述IL-15作为膜结合多肽和/或分泌多肽表达。3.权利要求1和2中任一项所述的NK细胞，其中所述IL-15的全部或功能部分与跨膜蛋白的全部或一部分融合。4.产生表达白介素-15(IL-15)的全部或功能部分的自然杀伤(NK)细胞的方法，其包括：a)将编码IL-15的全部或功能部分的核酸引入到所述NK细胞中；以及b)将所述NK细胞维持在其中表达所述IL-15的全部或功能部分的条件下，从而产生表达IL-15的全部或功能部分的NK细胞。5.权利要求4所述的方法，其中引入到所述NK细胞中的所述核酸包含CD8α的信号肽、IL-15的全部或功能部分以及CD8α的跨膜结构域的全部或一部分。6.权利要求4和5中任一项所述的方法，其中用载体转导所述NK细胞，所述载体表达与所述跨膜结构域的全部或一部分连接(例如，融合)的所述IL-15的全部或功能部分。7.权利要求6所述的方法，其中所述载体是病毒载体。8.自然杀伤(NK)细胞，其通过权利要求4至7中任一项所述的方法产生。9.组合物，其包含权利要求1至3或8中任一项所述的NK细胞。10.药物组合物，其包含权利要求1至3或8中任一项所述的NK细胞。11.权利要求10所述的药物组合物，其还包含IL-2的全部或功能部分。12.在有此需要的个体中治疗癌症的方法，其包括向所述个体施用表达白介素-...

【专利技术属性】
技术研发人员：达里奥·坎帕纳，大卫·舒克，今村胜，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，圣裘德儿童研究医院，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG