一种用于美容护肤的干细胞制剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于美容护肤的干细胞制剂及其制备方法。其中所述方法包括：a)提供从哺乳动物获得的干细胞；b)对干细胞进行原代培养；c)在添加有维生素A的干细胞培养基中对干细胞进行传代培养；d)更换为添加有黄芪甲苷的无酚红培养液，在低氧条件下继续培养；e)将干细胞连同培养液进行超声破碎，离心，收集上清液，并过滤除菌；f)检测上清液的总蛋白浓度，调整上清液总蛋白浓度。本发明专利技术提供的用于美容护肤的干细胞制剂的制备方法解决了常规培养方法体外培养细胞数目少，因子含量低等关键性问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及美容、护肤领域，具体涉及一种用于美容护肤的干细胞制剂及其制备方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的种子细胞，在不同的诱导条件下不仅能够分化形成骨、软骨、脂肪、肌肉等中胚层的细胞，还能跨胚层分化形成外胚层的神经元、神经胶质细胞、皮肤细胞以及内胚层的血管内皮细胞等多种组织细胞。除具有多向分化潜能外，MSC还可分泌多种细胞因子，MSC通过旁分泌的形式分泌EGF、KGF、VEGF、促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)、bFGF、IGF-1、Wnt1/3A/5A、HGF、PDGF-BB和EPO等众所周知能促进血管生成、促进组织细胞生物合成及能量代谢的细胞活性物质，其还可加强创面愈合。另外，这些因子可对调节表皮及上皮细胞生长、分化增殖、促进毛细血管生长、改善生长微环境、保持细胞活性等方面起着重要作用[1]。文献报道，极微量的EGF、FGF即能强烈促进皮肤细胞的分裂和生长，从而达到促进人皮肤的新陈代谢、促进再生修复、减缓皮肤衰老，使皮肤重新恢复弹性和光泽[2-3]。目前市售的细胞因子产品多是单一成分美容护肤品，也有以EGF和bFGF为活性成分添加到美容护肤品中，单一的一种或两种细胞因子不能满足皮肤修护、细胞更新的需求，多种因子联合应用才能促进表皮更新，多因子产品也将成为化妆品行业发展的必然趋势。中国专利CN1872025A和CN101461772A均涉及到干细胞分泌的细胞因子，均在空气氧浓度(约为21％)下进行培养扩增，文献报道[4]，微环境中O2浓度是非常重要的因素，对间充质干细胞的影响是多个方面的，空气氧浓度下培养的间充质干细胞分泌的细胞因子量较少，经过低氧条件(O2浓度为4％)培养的间充质干细胞分泌的各种因子量均有不同程度增加，另外，文献报道[5]，人体正常组织和组织间隙中的O2浓度在3％-9％，人类软骨细胞(无血管组织)生长环境的氧体积分数为0-7％，骨髓腔内浓度在1％-7％范围，说明间充质干细胞在体内处于低氧环境中，其是在此条件下分泌细胞因子发挥各种功能。相关文献已报道采用低氧培养可对个别细胞因子在一定程度上增加其含量，但是需要长时间低氧工艺，对培养条件要求高，且普通培养方法，干细胞经多次传代后出现分化现象，一旦分化就不再具备分泌干细胞相关因子的能力，而且分化细胞不能继续传代培养，以上问题不适于大批量生产。基于干细胞可分泌多种细胞因子的特征，本专利技术开发人干细胞美容护肤产品，及其美容护肤品添加的活性物质，选材源于人类，解决了部分人群因使用化学试剂产品产生的变态反应，这使得人们在心理、生理上更容易接受这类产品改善肌肤敏感人群的肤质。解决传统的物理化学美容所不能解决的问题，从本质上改善肌肤。本专利技术通过特殊培养工艺，添加维生素A使得干细胞传代倍数增加，传代至20代时仍具有干细胞分泌细胞因子的功能，同时采用黄芪甲苷刺激培养与低氧培养结合工艺，增加干细胞因子分泌，开发一种培养方法简单、细胞因子分泌功能强、细胞因子获取量高的制备方法，以少量原料实现批量获取，是一种适合于产业化的制备方法，为细胞因子应用于护肤美容行业、组织损伤修复领域奠定基础。
技术实现思路
本专利技术一方面提供了一种制备干细胞制剂的方法，其包括：a)提供从哺乳动物获得的干细胞；b)在干细胞培养基中，对干细胞进行原代培养；c)在添加有0.8-1.2μM的维生素A的干细胞培养基中，对干细胞进行传代培养至第15至20代；d)更换为添加有0.8-1.2μM黄芪甲苷的无酚红培养液，在1％至5％O2的条件下继续培养24小时；e)在将步骤d)培养后的干细胞连同培养液进行超声破碎，离心，收集上清液，并过滤除菌；f)检测步骤e)获得的上清液的总蛋白浓度，将上清液总蛋白浓度调整至9-11μg/μL。在一个具体的实施方案中，所述干细胞培养基是含2％血清替代物的α-MEM培养液。在一个具体的实施方案中，所述无酚红培养液是DMEM培养液或DMEM/F12培养液。在一个可选的实施方案中，所述干细胞选自脐血干细胞、脐带间充质干细胞、表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。在一个具体的实施方案中，其中在c)中，当细胞融合率达75％-85％时进行传代。在一个可选的实施方案中，上述方法还包括g)：将f)中经调整总蛋白浓度的上清液冷冻干燥，获得冷冻干燥品。在一个可选的实施方式中，0.8-1.2μM黄芪甲苷还可以采用1mg/mL黄芪多糖替代。其中，黄芪多糖中的主要有效成份是多糖和黄芪苷。黄芪苷分为黄芪苷Ⅰ、黄芪苷Ⅱ、黄芪苷Ⅳ。其中生物活性最好的是黄芪苷IV即黄芪甲苷。在一个具体的实施方案中，制备上述干细胞制剂的方法包括以下步骤：1)提供从哺乳动物获得的干细胞：采用相应细胞分离技术，从人的相应组织中分离出干细胞；2)在干细胞培养基中，对干细胞进行原代培养：使用含有2％血清替代物的α-MEM培养液，在37℃、5％CO2条件下采用细胞培养箱进行培养、扩增；3)干细胞的传代培养：在添加有1μM的维生素A的干细胞培养基中，对干细胞进行传代培养，视细胞的生长状态进行换液、传代，每隔一天传代一次，传代培养至第20代时，且融合率达75％-85％时，弃去上清液，换上含1μM黄芪甲苷的无酚红培养液DMEM；4)细胞因子富集：将步骤3)获得的细胞放入1％至5％的O2低氧培养箱中继续培养24h，使细胞因子分泌量增加；5)干细胞制剂的制备：将步骤4)处理过的细胞连同无酚红培养液DMEM进行超声破碎；细胞因子完全释放到培养体系中；再以4000r/min离心15min，收集上清液，弃去沉淀，上清液用0.22μm滤膜过滤，使其无菌；6)采用BCA法进行总蛋白浓度测定，调整蛋白浓度为10μg/μL；可选地蛋白浓度测定方法如Lowry法、磺基水杨酸沉淀法、Bradford法；7)干细胞制剂的冷冻干燥品的制备：将6)中多因子复合的干细胞制剂按照2-3ml/瓶灌装于西林瓶中，采取冷冻干燥技术获得干细胞制剂的冷冻干燥品。可选地，在步骤4)和步骤5)之间还可以进行细胞生物学相关检测：采用ELISA法分析培养上清液中几种因子的分泌量，包括EGF、bFGF、VEGF、KGF、Ang-I、PDGF、IGF-1、HGF。本专利技术另一方面提供了一种干细胞制剂，其通过上述的方法制备获得。在一个具体的实施方案中，所述干细胞制剂包括干细胞分泌的细胞因子包括但不局限于表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人血管生成素I(Ang-I)、促红细胞生成素(EPO)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、前列腺素E2(PGE2)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板源性生长因子(PDGF)。在一个具体的实施方案中，所述干细胞制剂还包括胶原蛋白、层粘蛋白、纤连蛋白、透明质酸。本专利技术另一个方面，提供了上述干细胞制剂、或上述方法制备的干细胞制剂在制备美容护肤产品和/或化妆品中的用途。在一个具体的实施方案中，所述干细胞制剂是液体形式。在另一个具体的实施方案中，所述干本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备干细胞制剂的方法，其包括：a)提供从哺乳动物获得的干细胞；b)在干细胞培养基中，对干细胞进行原代培养；c)在添加有0.8‑1.2μM的维生素A的干细胞培养基中，对干细胞进行传代培养至第15至20代；d)更换为添加有0.8‑1.2μM黄芪甲苷的无酚红培养液，在1％至5％O2的条件下继续培养24小时；e)在将d)中培养后的干细胞连同无酚红培养液进行超声破碎，离心，收集上清液，并过滤除菌；f)检测e)中获得上清液的总蛋白浓度，将上清液总蛋白浓度调整至9‑11μg/μL。

【技术特征摘要】
1.一种制备干细胞制剂的方法，其包括：a)提供从哺乳动物获得的干细胞；b)在干细胞培养基中，对干细胞进行原代培养；c)在添加有0.8-1.2μM的维生素A的干细胞培养基中，对干细胞进行传代培养至第15至20代；d)更换为添加有0.8-1.2μM黄芪甲苷的无酚红培养液，在1％至5％O2的条件下继续培养24小时；e)在将d)中培养后的干细胞连同无酚红培养液进行超声破碎，离心，收集上清液，并过滤除菌；f)检测e)中获得上清液的总蛋白浓度，将上清液总蛋白浓度调整至9-11μg/μL。2.根据权利要求1所述的制备干细胞制剂的方法，所述干细胞培养基是含2％血清替代物的α-MEM培养液。3.根据权利要求1或2所述的制备干细胞制剂的方法，其中所述无酚红培养液是DMEM培养液或DMEM/F12培养液。4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备干细胞制剂的方法，其中所述干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：田娜，张石林，尹晓光，
申请(专利权)人：吉林省拓华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22