使用新颖的阳离子性接枝聚合物的目标物分离浓缩方法技术

本发明专利技术的课题在于，提供代替现有的阳离子性聚合物的、对目标物分离浓缩的方法以及用于该方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请对2014年3月24日提出申请的日本专利申请2014－60419号及2014－60420号说明书主张优先权，上述日本申请的整体通过参照方式而引入本说明书。本申请说明书及上述2个日本申请中引用的全部文献的记载全部整合到说明书中。本专利技术涉及使用导入成本低、能够以简便的操作安全且稳定地制造的接枝聚合物的目标生物分子分离浓缩方法以及用于该方法的试剂盒。
技术介绍
离子交换聚合物是合成树脂的一种，分子结构的一部分具有电离为离子基形式的结构。与水等溶剂中的离子显示出离子交换作用，其行为按照对离子的选择性依据离子基的性质而大致分为阳离子交换聚合物与阴离子交换聚合物。通过利用聚合物中的固定离子与溶液中的各种抗衡离子(被交换的离子)的吸附差异，能够将溶液中包含的各离子分离。生物分子的电荷特性由分子整体的电荷、电荷密度、表面电荷的分布方式、溶液的pH等各种因素决定。例如，在蛋白质的情况下，包含弱酸性、弱碱性等多种离子性氨基酸，分子表面具有正电荷与负电荷两种。将该电荷的总和称为有效表面电荷，氨基酸的荷电状态根据pH而改变，因此蛋白质分子的有效表面电荷也依赖于溶液的pH而向正或负变化。离子交换色谱是利用这种生物分子的荷电状态(有效表面电荷)根据pH、盐浓度而改变而与具有相反电荷的载体可逆地结合、洗脱而进行回收的手法(例如专利文献1、2及非专利文献1)。但是，在进行所述回收操作时，由于洗脱时使用了表面活性剂、高浓度盐等，难以以目的物的立体结构得以维持、存活的状态进行回收。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开1996－173194号公报专利文献2:日本特开2002－125695号公报非专利文献非专利文献1:Microbiology152(2006)，3575－3583
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术提供使用新颖的阳离子性接枝聚合物代替现有的阳离子性聚合物对目标物分离浓缩方法、及用于该方法的试剂盒。用于解决课题的手段即，本专利技术为以下的[1]～[11]的本专利技术方案。[1]一种使用阳离子性接枝聚合物对目标物分离浓缩的方法，包含：(1)使阳离子性接枝聚合物与含有目标物的试样在碱性条件下接触，使目标物与阳离子性接枝聚合物结合的步骤；(2)将阳离子性接枝聚合物与目标生物分子的结合体分离的步骤；及(3)将目标物从上述结合体洗脱的步骤。＜这里，上述阳离子性接枝聚合物为多胺接枝聚合物，其是使多胺衍生物与烯属不饱和单体(c)聚合而得的，所述多胺衍生物是使具有至少1个氨基的高分子化合物(a)与具有至少1个环氧基的化合物(b)反应而得的＞；[2]根据上述[1]所述的方法，其中，步骤(1)还包括添加二价或三价的金属离子；[3]根据上述[1]或[2]所述的方法，其中，步骤(2)还包括对结合体进行洗涤的工序；[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，上述阳离子性接枝聚合物固定于固相表面。[5]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，步骤(3)包括使未与目标物结合的阳离子性接枝聚合物聚集的步骤。[6]一种试剂盒，其为用于上述[1]～[5]中任一项所述的方法的试剂盒，含有阳离子性接枝聚合物；[7]根据上述[6]所述的试剂盒，其中，还含有金属离子盐；[8]根据上述[6]所述的试剂盒，其中，还含有包含碱性溶液与金属离子盐的反应液；[9]根据上述[6]～[8]中任一项所述的试剂盒，其中，还含有洗涤液；[10]根据上述[6]～[9]中任一项所述的试剂盒，其中，还含有包含酸性溶液或螯合剂的分散液。[11]根据上述[6]～[10]中任一项所述的试剂盒，其中，还含有聚集液。专利技术的效果根据本专利技术的方法，能够将试样中的目标物高效地分离浓缩，且在分离浓缩的过程中，目标物与现有方法相比没有受到损伤，因此此后的解析容易进行。更详细而言，还能够用于使用质谱装置的解析。附图说明图1：大肠杆菌与阳离子性接枝聚合物的结合体的沉淀聚集块，左边的管为大肠杆菌(无)、右边的管为大肠杆菌(有)。图2：表达GFP的大肠杆菌与阳离子性接枝聚合物的结合体的荧光显微镜观察。利用激光波长(488nm)检测在大肠杆菌中表达的GFP，利用可见光检测阳离子性接枝聚合物与大肠杆菌。使用激光波长及可见光连续取得图像，用伪彩色显示进行了叠加。左图为大肠杆菌被阳离子性接枝聚合物捕获的状态、右图为将其聚集块用分散液分散的状态。图3：分离的大肠杆菌的存活确认。使阳离子性接枝聚合物与大肠杆菌反应，分别对离心后的上清与将聚集块用分散液分散而得的溶液进行培养。右半部分的图像为上清、左半部分为分散液。图4：使用分离回收的核酸进行的电泳。泳道1为无阳离子性接枝聚合物处理的样品的电泳图、泳道2为阳离子性接枝聚合物处理后样品的电泳图。图5：回收的细胞的检测。(1)使细胞与阳离子性接枝聚合物反应并离心后的上清(左)与聚集块(右)。(2)将该聚集块用分散液分散后的状态。(1)、(2)均利用激光波长350nm检测细胞核，利用可见光检测阳离子性接枝聚合物。使用激光波长及可见光连续取得图像。用伪彩色显示进行叠加，观察聚集状态及分散状态。图6：回收的细胞的荧光显微镜观察。利用阳离子性接枝聚合物进行捕获，用分散液分散后进行免疫染色。用激光波长350nm检测细胞核，用488nm检测与在细胞表面表达的抗原(MCAM)反应的抗体。使用2种激光波长连续取得图像。用伪彩色显示进行叠加，观察细胞表面抗原。图7：回收的囊泡的检测。(1)使囊泡与阳离子性接枝聚合物反应并离心后的上清(左)及聚集块(右)。(2)将该聚集块用分散液分散后的状态。(1)、(2)均利用激光波长488nm检测囊泡、利用可见光检测阳离子性接枝聚合物。使用激光波长及可见光连续取得图像。用伪彩色显示进行叠加，确认聚集状态及分散状态。图8：回收的囊泡的荧光显微镜观察。将利用阳离子性接枝聚合物捕获的囊泡用分散液分散后，进行免疫染色。利用激光波长488nm检测囊泡，利用激光波长594nm检测抗体。使用2种激光波长连续取得图像。用伪彩色显示进行叠加，确认囊泡表面的抗原的状态。图9：用加入了表面活性剂的溶液回收的大肠杆菌的检测(电泳)。图10：用加入了表面活性剂的溶液回收的大肠杆菌的检测(质谱分析)图11：噬菌体的分离检测图12：分离的大肠杆菌的存活确认。使用环氧辛烷改性聚烯丙基胺与二烯丙基二甲基氯化铵的接枝聚合物(PAAEpo－g－DADMAC)及丁酸缩水甘油酯改性聚烯丙基胺与二烯丙基二甲基氯化铵的接枝聚合物(PAAGB－g－DADMAC)进行大肠杆菌的分离。将接枝聚合物与乳胶珠混合后与菌体反应。图13：分离的大肠杆菌的存活确认。使用环氧辛烷改性聚烯丙基胺与二烯丙基二甲基氯化铵的接枝聚合物(PAAEpo－g－DADMAC)进行大肠杆菌的分离。使接枝聚合物与菌体反应后添加乳胶珠。图14：分离的大肠杆菌的存活确认。使用缩水甘油改性聚二烯丙基胺与二烯丙基二甲基氯化铵的接枝聚合物(DAAGly－g－DADMAC)进行大肠杆菌的分离。将接枝聚合物与乳胶珠混合后与菌体反应。图15：分离的大肠杆菌的存活确认。使用缩水甘油改性聚二烯丙基胺与二烯丙基二甲基氯化铵的接枝聚合物(DAAGly－g－DADMAC)进行大肠杆菌的分离。使接枝聚合物与菌体反应后添加乳胶珠。具体实施方式“阳离子性本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用阳离子性接枝聚合物对目标物分离浓缩的方法，包含：(1)使阳离子性接枝聚合物与含有目标物的试样在碱性条件下接触，使目标物与阳离子性接枝聚合物结合的步骤；(2)将阳离子性接枝聚合物与目标生物分子的结合体分离的步骤；及(3)将目标物从所述结合体洗脱的步骤，其中，所述阳离子性接枝聚合物为多胺接枝聚合物，其是使多胺衍生物与烯属不饱和单体(c)聚合而得的，所述多胺衍生物是使具有至少1个氨基的高分子化合物(a)与具有至少1个环氧基的化合物(b)反应而得的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.24 JP 2014-060420;2014.03.24 JP 2014-060411.使用阳离子性接枝聚合物对目标物分离浓缩的方法，包含：(1)使阳离子性接枝聚合物与含有目标物的试样在碱性条件下接触，使目标物与阳离子性接枝聚合物结合的步骤；(2)将阳离子性接枝聚合物与目标生物分子的结合体分离的步骤；及(3)将目标物从所述结合体洗脱的步骤，其中，所述阳离子性接枝聚合物为多胺接枝聚合物，其是使多胺衍生物与烯属不饱和单体(c)聚合而得的，所述多胺衍生物是使具有至少1个氨基的高分子化合物(a)与具有至少1个环氧基的化合物(b)反应而得的。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中还包括添加二价或三价的金属离子。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦泽一穗，野田健太，渡边晃司，照内洋子，文屋胜，
申请(专利权)人：日东纺绩株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP