类风湿性关节炎的血清学诊断方法技术

本发明专利技术处于诊断方法的领域。它提供了类风湿性关节炎的新标记抗体以及检测类风湿性关节炎的新方法。它还提供了预测受试者是否会发展类风湿性关节炎的手段和方法。本发明专利技术是基于发现类风湿性关节炎患者在他们的循环中具有与瓜氨酸化抗体特异性反应的抗体。在一个方面，本发明专利技术因此涉及包含瓜氨酸残基的抗体。在另一个方面，本发明专利技术提供了检测来自受试者的样品中类风湿性关节炎特异性抗体的方法，其中使所述样品与瓜氨酸化抗体接触并且其中测定所述样品是否包含与所述瓜氨酸化抗体特异性反应的抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术处于诊断方法的领域。它提供了类风湿性关节炎的新标记抗体以及检测类风湿性关节炎的新方法。它还提供了预测受试者是否会发展类风湿性关节炎的手段和方法。本专利技术是基于类风湿性关节炎患者在他们的循环中具有与瓜氨酸化抗体特异性反应的抗体这一发现。
技术介绍
血清学诊断性检验在类风湿性关节炎(RA)的早期检测和辩别中具有日益增长的重要性。除传统的类风湿因子检测之外，瓜氨酸化抗原的新的特异性自身抗体已经为RA的诊断做出了重大贡献[26]。类风湿因子是自身抗体，其可以是IgM、IgG或IgA，并且在1922年被首次提到[1]。它识别人类IgG的Fc片段的CH2和CH3域并且是由美国风湿病学会(AmericanCollegeofRheumatology)出版的RA分类标准的组分[2]。类风湿因子(RF)可以通过各种试验方法测定；ELISA(酶联免疫吸附分析法)和比浊法是标准化方法。RF检测的平均特异性约79％，灵敏度约60％[3]。近年来，在RA患者的血清中已经检测并表征出新的自身抗体。它们表现出更高的特异性并因此能有助于改进血清学诊断性检验。近年来风湿病学中最重要的血清学发现之一是针对瓜氨酸化聚角蛋白微丝蛋白(filaggrin)的自身抗体的表征[4]。该发现的起点是抗角蛋白抗体(AKA)的靶抗原的鉴定。这些在1979年首次描述并且对RA是高度特异性的[4]。所述靶抗原聚角蛋白微丝蛋白只在上皮细胞中表达而在关节或其他器官不表达，因此这种发现的致病意义最初是不清晰的。Schellekens等[6]表明AKA只识别聚角蛋白微丝蛋白的瓜氨酸化形式。聚角蛋白微丝蛋白可以通过精氨酸残基的酶脱亚胺(deimination)而瓜氨酸化，以产生瓜氨酸残基。瓜氨酸化是一种翻译后修饰，其改变蛋白质的电荷，导致它三维结构的变化，后者又导致抗原性性质的变化[7]。瓜氨酸化在细胞分化和细胞程序性死亡(凋亡)中具有必要的生理和生化作用。检测抗瓜氨酸化聚角蛋白微丝蛋白抗体的第一代ELISA显示对RA的特异性约85％，灵敏度65％至70％。第二代ELISA使用合成肽作为抗原，所述合成肽由于分子内二硫键形成而有环状结构。使用这些环状的瓜氨酸化肽(CCP)将特异性改善到96％和98％之间，灵敏度不变[8]。几项研究现在已经表明，抗CCP抗体不仅是高度特异性的，而且对于所述疾病的侵蚀过程有高度预测价值并因此具有预后价值[9]。关于纤维蛋白和纤维蛋白原的瓜氨酸化肽的研究现在已经表明了聚角蛋白微丝蛋白和瓜氨酸化纤维蛋白之间的交叉反应[12]。一些出版物已经发现对于在RA患者中检测抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体的高度诊断特异性和灵敏度[13]。与ELISA一起，对于RA的灵敏度约75％，特异性为98％。另一种感兴趣的瓜氨酸化自体抗原是α-烯醇酶的瓜氨酸化形式，所述酶在糖酵解中发挥作用[15]。瓜氨酸化α-烯醇酶已经在类风湿性关节炎患者的滑膜组织中与其他瓜氨酸化抗原一起检测出[16]。瓜氨酸化波形蛋白已被描述为在滑膜组织中表达的相关自身抗原。随后，阐明了瓜氨酸化波形蛋白与以前已知的抗原Sa一致，Sa代表Savoie，即首次鉴定出相应自身抗体应答的患者的名字。对于类风湿性关节炎患者，抗Sa抗体提供了>98％的高特异性，但灵敏度有限，22％至40％[17]。一段时间以来，基于突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)的ELISA已经可商购用于诊断类风湿性关节炎，并且具有与抗CCP抗体大致相同的诊断灵敏度和特异性[18，19，20]。还描述了在RA患者的血清中出现针对氨甲酰化蛋白(包含高瓜氨酸残基的蛋白)的抗体(28，29)。发现高瓜氨酸在类风湿结节中与瓜氨酸一起存在(28)，并发现针对氨甲酰化蛋白的抗体预测关节损伤(29)。最近已经开发了两种用于RA早期检测的血清学现场检验(pointofcaretest)(POCT)。Rheuma-Chec检验(Orgentec，Mainz，德国)结合了两种用于诊断RA的生物标志物—类风湿因子和MCV抗体。CCP抗体用CCPoint分析法(Euro-Diagnostica，瑞典)检测[25]。所述检验只需要一滴全血并且任何全科医生都可以在几分钟内施行它们。尽管有上述进步，但仍有改进类风湿性关节炎现有的血清学检验的空间，特别是在灵敏度、特异性和易于操作方面。
技术实现思路
现在已经意外地发现，类风湿性关节炎(RA)患者产生针对瓜氨酸化抗体的抗体。这允许制造各种形式的新的诊断性检验。本专利技术因此涉及包含瓜氨酸残基的抗体。本专利技术还涉及这样的抗体的诊断性应用，例如作为抗原来测定RA患者或倾向于发展RA的受试者的循环中抗瓜氨酸化抗体(ACA)的存在。本专利技术因此还涉及预测受试者是否已经或将发展RA的方法。附图说明图1：ELISA分析法结果。来自正常对照受试者(n＝7)和没有类风湿因子的RA患者(n＝7)的血清在ELISA分析法中以1:100稀释度用固定化的瓜氨酸化兔IgG抗体作为抗原进行检验。具体实施方式我们发现类风湿性关节炎(RA)患者产生抗体，所述抗体特异性针对包含瓜氨酸或高瓜氨酸残基的抗体。这些抗体在本文中将被称为瓜氨酸化抗体。我们以两种方式制备瓜氨酸化抗体。第一，我们通过将家兔IgG的纯化制品进行用肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD，EC3.5.3.15)处理来制备瓜氨酸化抗体。这种酶催化蛋白质结合型精氨酸转化成瓜氨酸[27]。我们还通过化学氨甲酰化制备了瓜氨酸化抗体。在这种方法中，抗体中存在的赖氨酸残基转化为高瓜氨酸残基。我们由此得到瓜氨酸化兔IgG抗体(实施例1和2)。如本文中定义，术语“抗体”用来指称能够与通常称为抗原的靶化合物特异性结合的特异性结合分子，例如蛋白质、或其部分。这样的特异性结合分子的优选实例是多肽或蛋白或其部分，例如单链可变片段(scFv)、抗原结合片段区(Fab)、单域抗体(sdab)亦称VHH抗体、纳米抗体(骆驼来源的单域抗体)、或称为VNAR的鲨鱼IgNAR来源的单域抗体片段、或其其他活性组分例如蛋白质适配体。在一种替代实施方式中，特异性结合分子是包含抗体的抗原结合域的融合蛋白。在功能型语言中，术语“抗体”是指能够与经常被称为“抗原”的靶分子特异性结合的蛋白质或多肽。抗体(亦称免疫球蛋白)优选是在脊椎动物的血液或其他体液中发现并被免疫系统用于识别和中和外来物例如细菌和病毒的γ球蛋白。天然存在的人类抗体通常由各自具有两个大的重链和两个小的轻链的基本结构单元构成，形成例如，具有一个单元的单体、具有两个单元的二聚体或具有五个单元的五聚体。抗体由一种称为B细胞的白细胞产生。有几种不同类型的抗体重链、和几种不同种类的抗体，所述抗体基于它们拥有的重链而分为不同的同种型。已知五种不同的抗体同种型在哺乳动物中执行不同的作用，并帮助对于它们遇到的各种不同类型的外来物引导适当的免疫应答。一些动物物种例如骆驼(例如美洲驼)和鲨鱼可具有异常的抗体结构。虽然所有抗体的一般结构很相似，但在蛋白质末端的小区域是极为可变的，使得存在数百万具有稍有不同的末端结构的抗体。这个区域被称为高变区。这些变体各自可以与称为抗原的不同的靶结合。这种巨大的抗体多样性允许免疫系统识别同等广泛的抗原多样性。所述抗原被抗体识别的独特部分称作表位。这些表位与它们的抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体，其包含瓜氨酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.05 EP 14166985.31.一种抗体，其包含瓜氨酸残基。2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体针对红血细胞的细胞外表面的组分。3.根据权利要求2所述的抗体，其与血型糖蛋白反应。4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述血型糖蛋白是血型糖蛋白A。5.检测来自受试者的样品中对类风湿性关节炎特异性的抗体的方法，其中使所述样品与权利要求1-4任一项所述的抗体接触并且其中测定所述样品是否包含与权利要求1-4任一项所述的抗体特异性反应的抗体。6.根据权利要求5所述的方法，其中瓜氨酸化抗体被固定在固体载体上。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述固体...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁努斯·胡贝图斯·莱昂纳德斯·萨尔登，
申请(专利权)人：诺维奥斯玛特，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL