一种淫羊藿总黄酮酶解产物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种淫羊藿总黄酮酶解产物，它是将淫羊藿总黄酮通过固定化蜗牛酶酶解产生的，该酶解产物具有比淫羊藿总黄酮原型及游离酶酶解产物更好的抗肿瘤活性，且具有较好的口服吸收性。本发明专利技术还公开了所述酶解产物的制备方法，所述方法采用固定化酶酶解淫羊藿总黄酮，选用的蜗牛酶和固定载体结合效率高，稳定性好，酶解转化率高，并且固定化酶还能够循环使用，可节约资源，实现绿色生产。本发明专利技术还涉及酶解产物在抗肿瘤中的应用，按照本发明专利技术提供的技术方案获得的淫羊藿总黄酮酶解产物对人肺癌A549细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌MCF‑7细胞、宫颈癌Hela细胞具有显著的增殖抑制作用，可用于肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种淫羊藿总黄酮酶解产物，该产物是将淫羊藿总黄酮通过固定化蜗牛酶酶解产生的。本专利技术还涉及该酶解产物的制备方法和在抗肿瘤方面的应用，属于医药

技术介绍
淫羊藿作为传统的补肾中药，在民间沿用已有千年历史，具有补肾阳，强筋骨、祛风湿的作用，临床常用于治疗阳痿遗精，筋骨萎软，风湿痹痛等症。淫羊藿主要含有黄酮类成分，主要有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B，朝藿定C和宝藿苷I等黄酮苷(结构见图1)。现代药理研究表明，淫羊藿黄酮苷具有很好的生物活性，除具有抗骨质疏松活性外，还具有很好的抗肿瘤作用。文献报道淫羊藿黄酮类成分对呼吸道系统肺癌肿瘤、对消化系统肝癌和胃癌、对血液系统白血病细胞具有一定的杀伤能力，能够控制肿瘤细胞的生长，促使肿瘤细胞的死亡，抑制肿瘤血管形成、并可以有效地调节机体内特异、非特异的免疫细胞，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，从而起到抗肿瘤作用。本课题组前期研究表明，口服淫羊藿黄酮苷，原型吸收较少，需要经过肠道酶肠道菌的水解，以次级苷或苷元的形式被吸收而发挥疗效。因此在体外寻找将淫羊藿黄酮苷适宜酶解的方法，获得活性较高且易于吸收的次级苷，对进一步研发具有较好抗肿瘤作用的新药应用于临床具有重要意义。目前，已有较多关于体外酶解淫羊藿黄酮原型苷的研究，但这些方法多是利用游离酶酶解淫羊藿苷，如利用β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蜗牛酶或曲霉属霉菌产生的诱导酶转化淫羊藿苷的研究。但游离酶对反应体系的微环境十分敏感，任何pH、温度的改变均会使其活性受到影响，并且难于循环使用、花费代价高，不利于大规模工业生产。由于淫羊藿中除了含有淫羊藿苷成分外，还含有另外三种含量较多的黄酮类成分：朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C。因此，单纯从淫羊藿药材中提取淫羊藿苷再进行酶解，不仅需要繁琐的分离提纯步骤，而淫羊藿药材中的有效成分不能充分利用，不利于中药资源的合理化应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种淫羊藿总黄酮酶解产物，该产物是将淫羊藿总黄酮通过固定化蜗牛酶酶解产生的，该酶解产物具有比淫羊藿总黄酮原型及游离酶酶解产物更好的抗肿瘤活性，且具有较好的口服吸收性，提高了对淫羊藿有效成分的利用率，实现了药材资源的综合利用，并且产物制备所用的固定化酶能够循环使用，可节约资源，实现绿色生产。针对上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种淫羊藿总黄酮酶解产物，所述酶解产物通过固定化蜗牛酶酶解淫羊藿总黄酮获取，所述蜗牛酶由氨基介孔硅固定。其中，所述淫羊藿总黄酮的制备方式为：将淫羊藿用6～40(m/v)倍量40％～90％乙醇采用热回流提取后浓缩，经大孔吸附树脂法进一步纯化，得到质量含量不低于60％的淫羊藿总黄酮。其中，淫羊藿总黄酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷Ⅰ的总质量含量不低于30％(HPLC测得)。一种优选的氨基介孔硅的制备方法为：将二氧化硅浸入溶有3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯中，磁力搅拌800r·min-1，在90℃高温下，反应12h；取出反应物，在甲苯中超声洗涤10min，在60℃下真空干燥2h。进一步的，所述蜗牛酶的固定方法为：将蜗牛酶和氨基介孔硅载体置于pH5.0磷酸缓冲盐溶液中反应，室温下磁力搅拌反应；之后蒸馏水洗涤后干燥保存。其中，所述蜗牛酶与氨基介孔硅载体用量为质量比1：1～1：4，优选1：1。蜗牛酶与氨基介孔硅的结合效率在质量比1：1～1：4间递增，质量比1：4时蜗牛酶与介孔硅的结合效率达到最大，可达到90％以上，但考虑制备成本，最终选择蜗牛酶与介孔硅的质量比为1：1，既减少了介孔硅载体的用量，也可保持有效的结合效率，在此条件下，蜗牛酶与氨基介孔硅的结合效率可达到89.63％。进一步的，酶解条件优选为：氨基介孔硅固定化蜗牛酶和淫羊藿总黄酮加入含有40％体积分数DMSO的缓冲盐溶液中，缓冲盐溶液pH5.0，氨基介孔硅固定化蜗牛酶和淫羊藿总黄酮质量比为1：1，在50℃温度条件下反应，反应2h。本专利技术所述酶解产物中几乎没有淫羊藿苷元，其酶解产物主要由箭藿苷A；箭藿苷B；鼠李糖基淫羊藿次苷II；宝藿苷I组成；其组成比例约为箭藿苷A：箭藿苷B：鼠李糖基淫羊藿次苷II：宝藿苷I为1.5：2.0：1.0：5.8。本专利技术的第二目的在于提供一种淫羊藿总黄酮酶解方法，具体技术方案为，采用固定化蜗牛酶酶解淫羊藿总黄酮，其中所述蜗牛酶的固定载体选用氨基介孔硅。采用本专利技术所述的固定化蜗牛酶方法酶解淫羊藿总黄酮，蜗牛酶和载体的结合效率高，反应的适宜pH范围增宽，对反应温度也具有更好的适应性，稳定性好，并且酶解转化率高。此外，本专利技术进一步要求保护上述淫羊藿总黄酮酶解产物在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术所述的固定化蜗牛酶对淫羊藿总黄酮酶解产物，比淫羊藿总黄酮原型及游离酶酶解产物具有更好的抗肿瘤活性，且具有较好的口服吸收性。采用本专利技术所述氨基介孔硅固定化蜗牛酶方法酶解淫羊藿总黄酮，固定化酶不仅保留了游离酶的优点，还具有易于与底物分离，便于回收重复再利用，适宜的反应条件范围宽，可降低生产成本、适宜工业化生产等优势。并且蜗牛酶和氨基介孔硅载体的结合效率高，稳定性好，并且酶解转化率高。另外，本专利技术还实现了对淫羊藿中除淫羊藿苷以外的黄酮类成分的有效利用，提取淫羊藿中的总黄酮成分进行酶解，提高了淫羊藿药材有效成分利用率，实现了药材资源的综合利用。更重要的是，淫羊藿总黄酮经氨基介孔硅固定蜗牛酶酶解产物比原型化合物及经游离酶酶解的产物具有更好的抗肿瘤活性，以此为原料研发抗肿瘤新药具有较好的临床应用价值。附图说明图1为淫羊藿总黄酮所含主要黄酮及酶解产物的化学结构示意图；图2为氨基介孔硅固定化蜗牛酶的SEM表征示意图(放大倍数为8.1mm×50.0k)；图3为氨基介孔硅固定化蜗牛酶相对酶活和转化率随温度变化示意图；其中，A为相对酶活，B为转化率，(n＝3，*P<0.05，**P<0.01)；图4为氨基介孔硅固定化蜗牛酶相对酶活和转化效率随贮藏时间变化示意图；其中A为相对酶活；B为转化率(n＝3)；图5为氨基介孔硅固定化蜗牛酶酶解淫羊藿总黄酮最适反应条件考察示意图；其中，A为以酶活为指标的最适反应pH；B为以转化率为指标的最适反应pH；C为以酶活为指标的最适反应温度；D为以转化率为指标的最适反应温度；E为以酶活为指标的最适酶与底物质量比；F为以转化率为指标的最适酶与底物质量比；图6为淫羊藿总黄酮及其酶解产物的HPLC图谱；其中，A为混合对照品溶液；B为淫羊藿总黄酮酶解产物，其中1为游离蜗牛酶酶解总黄酮产物，2为氨基介孔硅固定化蜗牛酶酶解总黄酮产物；a.朝藿定A；b.朝藿定B；c.朝藿定C；d.淫羊藿苷；e.箭藿苷A；f.箭藿苷B；g.鼠李糖基淫羊藿次苷II；h.宝藿苷I；i.淫羊藿苷元；图7为淫羊藿总黄酮及其固定化酶酶解产物对A549、HepG2、MCF-7、Hela细胞作用48h的抑制率比较示意图；其中，A为A549细胞；B为HepG2细胞；C为MCF-7细胞；D为Hela细胞；(n＝6，*P<0.05，**P<0.01)；图8为游离酶和固定化酶酶解淫羊藿总黄酮的产物对A549、HepG2、MCF-7、Hela细胞作用48h的抑制率比较示意图；其中，A为MCF-7细胞；B为Hela细胞；C为HepG2细胞；D为A5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淫羊藿总黄酮的酶解产物，其特征在于，所述酶解产物通过固定化蜗牛酶酶解淫羊藿总黄酮获取，所述蜗牛酶的固定载体选用氨基介孔硅。

【技术特征摘要】
1.一种淫羊藿总黄酮的酶解产物，其特征在于，所述酶解产物通过固定化蜗牛酶酶解淫羊藿总黄酮获取，所述蜗牛酶的固定载体选用氨基介孔硅。2.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮酶解产物，其特征在于，所述淫羊藿总黄酮的制备方法为：将淫羊藿用6~40（m/v）倍量40%~90%乙醇采用热回流提取后浓缩，经大孔吸附树脂法进一步纯化，得到质量含量不低于60%的淫羊藿总黄酮。3.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮酶解产物，其特征在于，所述淫羊藿总黄酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I的总质量含量不低于30%。4.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮酶解产物，其特征在于，所述氨基介孔硅的制备方法为：将二氧化硅浸入溶有3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯中，磁力搅拌800r·min-1，在90℃高温下，反应12h；取出反应物，在甲苯中超声洗涤10min，在60℃下真空干燥2h。5.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮酶解产物，其特征在于，所述蜗牛酶的固定方法为：将蜗牛酶和氨基介孔硅载体置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈彦，刘聪燕，彭静，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32