一种针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术提供了一种针对EML4‑ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统及其制备方法。该方法针对治疗EML4‑ALK融合突变型非小细胞肺癌的需求，选择ALK和micRNA‑301两个靶点进行基因治疗，通过促进EML4‑ALK型肺癌中抑癌基因BIM的表达从而引起凋亡。本发明专利技术采用金纳米壳作为核心，利用化学键将ALK和micRNA‑301的干扰序列连接在其表面，并通过静电吸附作用将阿霉素上载到最外层。这一结构不仅提高了核酸药物的稳定性，还能够在肿瘤部位聚集，实现了热疗、化疗与基因治疗一体化的治疗方式，为治疗EML4‑ALK融合突变型非小细胞肺癌提供了新的方法和思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米药物领域，涉及一种针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统的制备方法。
技术介绍
肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌癌(NSCLC)发病率占所有肺癌发病率的80％，是影响人类生命健康的重要杀手。EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌是一类恶性程度更高、治疗更为困难的肺癌，而观有的治疗方法比较单一低效。棘皮动物微管相关蛋白4(echinodermmicrotubule-associatedprtein-like4，EML4)和间变性淋巴瘤酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)两个基因分别位于人类2号染色体的p21和p23带，相隔约10Mb距离。这两个基因片段的倒位融合能够使得组织表达新的融合蛋白EML4-ALK。通过体外克隆转化实验和体内基因重组基础上的肺部选择性表达实验证实：不同的EML4-ALK融合突变体均具有恶性转化和致瘤的能力。根据这些证据可以将融合基因定义为肺癌的一种新的癌基因。2007日本学者Soda等在1例吸烟的肺腺癌患者肿瘤组织中首先发现了EML4和ALK基因融合的致瘤性的变异基因-EML4-ALK，自此该类肺癌逐步被人们重视起来。研究报道EML4-ALK突变有很强的排他性，即当它突变时，其他驱动基因往往不会发生变异，EML4-ALK融合基因很难与EGFR等突变共存。因此临床上针对非小细胞肺癌EGFR突变的靶向抑制剂对于发生EML4-ALK融合的患者的预后效果非常不好。针对这类患者，EML4-ALK融合基因成为了NSCLC的重要治疗靶标，具有重要临床意义。基因治疗可通过一定方式将基因片段(DNA，RNA)导入细胞内对某靶点的mRNA进行抑制。TakezawaK等研究表明在EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌中，ALK蛋白的过表达会激活JAK/STAT3，RAS/ERK信号通路从而抑制抑癌基因BIM的表达，促进肿瘤细胞的发生发展。ChenZ等发现在胰腺癌细胞中，微小RNAmicRNA-301的存在会对BIM的表达起到负调控作用，从而加重了肿瘤细胞的恶性程度。金纳米壳是一种粒径在30nm左右的球形核壳结构的纳米载体，其有良好的光热转换效率，能够吸收800nm的近红外光而转换成热能用于体内热疗的应用。其比表面积比较大，有较高的药物上载能力，是一种比较高效的siRNA纳米载体。同时可以利用金表面与巯基的共价结合将肿瘤靶向配体修饰到金纳米壳表面，赋予其肿瘤靶向能力。金纳米壳在光照后具有突出的热效应，高温会将巯金键断开，从而可以进行光触发式的基因控制释放。同时金纳米壳所释放的热能可以用于对肿瘤组织的热杀伤，聚焦的热量可以在宏观组织层面将肿瘤细胞杀死。所以如果将基因治疗与热疗联合应用，可以利用基因治疗在微观层面上的治疗优势与热疗相结合，使治疗效果得到放大，充分发挥基因治疗与热疗的协同作用。因此，在本领域期望能够开发针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的将纳米材料、核酸药物以及化学抗癌药物结合在一起的抗癌产品，以期产生热疗、化疗及基因治疗的多重效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌的复合型智能纳米载药系统，能够对非小细胞肺癌的治疗产生更好的效果。为达到此目的，本专利技术采用了以下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统，所述载药系统由金纳米壳、ALK干扰序列、micRNA-301干扰序列以及阿霉素制备得到。本专利技术针对已有的金纳米壳制备方法进行优化，合成出稳定均一的金纳米壳粒子溶液，并采用PEG的修饰提高纳米粒子溶液稳定性。将有巯基修饰的双链干扰序列共价连接到金纳米壳表面，优化寻找纳米粒子与干扰序列结合的最佳合成配比关系，大大提升了纳米载药系统对肿瘤细胞的杀伤作用，可以产生热疗、化疗及基因治疗的协同治疗效果，使治疗更加高效。另一方面，本专利技术的具体技术方案主要包括以下三个方面：(1)合成金纳米壳作为核心：采用硝酸银、柠檬酸三钠和氯金酸等材料，利用形成银核金壳的纳米结构，对其中金银的配比及反应条件进行细致优化，在合成好后，将一定比例的修饰有巯基和羧基的PEG分子连接到金壳表面，从而提高粒子稳定性，将一定量的RGD多肽与PEG分子中的羧基进行共价连接，对制备好的金纳米壳进行紫外、粒径、电镜等方面的表征，以证明获得均一稳定的金纳米壳溶液。这一部分的关键是确定金银的配比及PEG加入的量，因为有文献报道，少量PEG可提高纳米粒子稳定性，但过量的PEG则会抑制纳米粒子被细胞摄取，所以需要通过多组平行实验确定能使得金纳米壳保持稳定的最小PEG量。(2)上载ALK干扰序列及micRNA-301干扰序列：取一定量的ALK干扰序列和micRNA-301干扰序列巯基修饰序列连接到金纳米壳的表面，利用离心重悬的方法对合成好的载体进行分离纯化，没有连接到金纳米壳表面的序列则会在离心后漂浮在上清溶液中。在这一部分，优化了反应过程，寻找最优的序列连接数量。(3)吸附阿霉素：在步骤(2)得到的沉淀中加入一定浓度的阿霉素溶液，使其吸附上去，未吸附的阿霉素通过离心去除。这一部分的关键是优化载药量和反应时间。本专利技术以基因治疗为切入点，利用金纳米壳的热效应及高效基因上载特性，针对基因双靶点进行抑制，并加入阿霉素作为辅助治疗，将基因治疗、化疗与热疗联合利用来协同治疗融合型非小细胞肺癌，给予临床预后不好的EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌提供新的治疗思路与方法。附图说明图1为实施例1制备的纳米载药系统的紫外吸收图谱；图2为实施例1制备的纳米载药系统中干扰疗列和阿霉素的释放测定结果图；图3为实施例3中对本专利技术实施例1制备的纳米载药系统的热效应考察结果图；图4为实施例4中对本专利技术实施例1制备的纳米载药系统中的细胞存活率的测定结果。具体实施方式实施例1一种针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统的制备及紫外吸收测定：在50ml的水加入0.0017g硝酸银和0.007g柠檬酸三钠，搅拌并加热至65℃，反应0.5h后加入0.038g硼氢化钠，继续反应2h。然后将温度降至室温，加入0.0556g盐酸羟胺及0.017g硝酸银，反应过夜。最后，将体系加热至65℃并快速加入1ml浓度为25mM的氯金酸。反应4h后即可得到浓度为1nM的金纳米壳溶液。加入适量PEG提高金纳米壳溶液的稳定性。分别取10ul浓度为10uM的ALK干扰序列及micRNA-301干扰序列至1ml金纳米壳溶液中(ALK干扰序列及micRNA-301干扰序列由上海生工公司合成，具体序列如表1所示)，室温搅拌12h后加入100ul的20×SSC溶液进行盐化，反应过夜后12000rpm离心，去掉上清中未连接的干扰序列，在沉淀中加入浓度为0.5mg/ml的阿霉素溶液1ml，室温搅拌24h后12000rpm离心，去掉上清中末吸附上的阿霉素，加入1ml水吹打并离心，反复多次至上清呈无色后加1ml水重悬。取适量上述纳米载药系统，用紫外分光光度计进行检测，得到相应的紫外吸收图谱。如图1所示，两种干扰序列的吸收峰在260nm，阿霉素的吸收峰在520n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对EML4‑ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统及其制备方法，其特征在于，所述载药系统由金纳米壳、核酸药物、化学抗癌药物制备得到，并且可通过相应波长的光触发。

【技术特征摘要】
1.一种针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统及其制备方法，其特征在于，所述载药系统由金纳米壳、核酸药物、化学抗癌药物制备得到，并且可通过相应波长的光触发。2.根据权利要求1，该纳米载药系统是针对ALK及micRNA-301两个靶点进行治疗。3.根据权利要求1-3中任一项所述的针对EML4-ALK融合突变型非小细胞肺癌治疗的复合型智能纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斯文，顾月清，刘雨溪，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32