小分子增强胰腺内分泌细胞中的MAFA表达的用途制造技术

本发明专利技术提供了用以促进多能干细胞分化成成熟表型的胰腺内分泌细胞的方法、细胞培养物和分化培养基。所得的胰腺内分泌细胞表达单激素胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在一个或多个分化阶段中，可在空气‑液体界面处在培养容器中进行培养。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年5月16日提交的美国临时专利申请序列号61/994,259的权益，该申请全部内容据此以引用方式并入本文以用于所有目的。
本专利技术涉及用于多能干细胞的分化的方法，以及由此产生的细胞和群体。具体地讲，本专利技术涉及某些小分子生成胰腺内分泌细胞和此类细胞群的用途，所述细胞和细胞群表现出增加的MAFA表达。
技术介绍
用于Ⅰ型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得人们把注意力集中在开发适于移植的胰岛素分泌细胞或β细胞的来源上。一种方法是由多能干细胞诸如胚胎干细胞生成功能性β细胞。在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后结构域，所述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，HHEX和SOX2识别内胚层的前区，而CDX1、CDX2和CDX4识别内胚层的后区。内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这有助于肠管的分区。这通过多种分泌因子，诸如成纤维细胞生长因子(“FGF”)、WNTS、转化生长因子β(“TGF-β”)、视黄酸、和骨形态发生蛋白质(“BMP”)配体以及它们的拮抗剂来实现。例如，FGF4和BMP促进预定后肠内胚层中的CDX2表达并阻遏前基因HHEX和SOX2的表达(2000Development,127:15631567)。还证明了WNT信号转导与FGF信号转导并存，能够促进后肠发育并控制前肠命运(2007Development,134:22072217)。最后，由间充质分泌的视黄酸调控前肠-后肠边界(2002Curr.Biol.,12:1215-1220)。特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管的过程中，肠管变得分区成广泛结构域，所述广泛结构域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。肠管中分区的胰腺域显示出PDX1具有极高表达，但CDX2和SOX2的表达却非常低。PDX1、NKX6.1/PTFlA和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；而CDX2在肠组织中高度表达。胰腺形成源于定形内胚层分化成胰腺内胚层。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠还会分化成食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝和胆管系统。胰腺内胚层细胞表达胰十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。成熟胰腺由胰腺内胚层分化产生的外分泌组织和内分泌组织构成。D’Amour等人描述了在高浓度活化素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(NatureBiotechnology2005,23:1534-1541；美国专利7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF-10和视黄酸后，这些衍生自人胚胎干细胞的定形内胚层细胞还可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利申请公布2005/0266554)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利7,534,608和7,993,920)。Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利7,033,831)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和活化素A的组合而分化成内胚层(美国专利7,326,572)。然后将这些细胞与结合有EGF或β-细胞素的BMP拮抗物(诸如头蛋白(Noggin))一起培养，以生成PDX1阳性细胞。用烟酰胺诱导终末分化。一直以来，还使用小分子抑制剂来诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，已使用TGF-β受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development2011,138:861-871；Diabetes2011,60:239-247)来显著增加胰腺内分泌细胞的数量。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞(Curr.Opin.CellBiol.2009,21:727-732；NatureChem.Biol.2009,5:258-265)。HB9(也称为HlXB9和MNX1)是一种在胰腺发育早期表达的碱性螺旋-环-螺旋(“bHLH”)转录活化因子蛋白，其始于大约胚胎期第八天。在胚胎期的第十天半左右，HB9在胰腺上皮中表达PDX1和NKX6.1的细胞内瞬时表达，水平达到峰值。HB9表达在第十二天半左右开始衰退，且在后期，只局限于β细胞内。在HB9的无效突变的纯合子小鼠中，胰腺的背瓣无法发育(Nat.Genet.23:67-70,1999；Nat.Genet.23:71-75,1999)。HB9-细胞/β-细胞表达低水平的葡萄糖转运蛋白GLUT2和NKX6.1。此外，HB9-/-胰腺显示胰岛素阳性细胞数目明显减少，但这种细胞数目减少并未显著影响其它胰腺激素的表达水平。时序控制HB9对于β细胞正常发育并具有正常功能是至关重要的。虽然我们不太清楚有哪些因子调节HB9在β细胞中的表达，但近期用斑马鱼作的研究揭示，视黄酸可能对HB9表达有正向调节作用(Development,138,4597-4608,2011)。在全文以引用方式并入本文的美国专利申请序列号13/998,883中，证明了三碘化钾腺氨酸(“T3”)在朝向β细胞分化细胞中可充当HB9蛋白质表达的诱导剂。本文还公开了使用T3和T4中的一者或两者生成对NKX6.1、PDX1和HB9呈阳性的胰腺内胚层细胞的方法。另外，并且如全文以引用方式并入本文的美国专利申请序列号13/998,884所述，证明了胰腺内分泌标志物的表达可通过在空气-液体界面处培养以及使用T3和活化素受体样激酶(“ALK”)5抑制剂来显著增强。各种转录因子调节胰腺内分泌细胞向胰岛素分泌β细胞的分化。在这些因数中存在v-maf禽类肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(“MAFA”)。事实上，据信MAFA可为葡萄糖刺激的胰岛素分泌的β细胞中的主调节物。一般来讲，祖细胞分化成功能性β细胞的过程经历多个阶段，并且对从祖细胞诸如人多能干细胞生成胰腺细胞的方案的改善已经取得了显著进展。虽然有这些研究进展，但是祖细胞分化过程中的每一步骤均提出独特的挑战。因此，为了产生功能性内分泌细胞，并且具体地讲，功能性β细胞的目的，仍存在对于进一步分化方案发展的需要。具体地讲，希望开发其中胰腺内分泌细胞中的MAFA的表达增强的方法。附图说明图1A至图1M为示出来自以下各项的基因表达的倍数变化的实时PCR分析的数据的图表：PDX1、NKX6.1、PAX4、PAX6、NGN3、MAFA、ABCC8、嗜铬粒蛋白-A、G6PC2、IAPP、胰岛素、胰高血糖素的未分化ES细胞以及来自根据实施例1分化的干细胞系H1的PTF1a。图2A至图2C示出根据实施例1分化并且针对以下各项进行染色的第3阶段细胞的FACS分布图：图2A中用Ki67(Y轴)共染色的PD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外细胞培养物，包含分化的多能干细胞的群体，所述分化的多能干细胞表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物，其中至少10%的所述分化的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.16 US 61/9942591.一种体外细胞培养物，包含分化的多能干细胞的群体，所述分化的多能干细胞表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物，其中至少10%的所述分化的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。2.一种在衍生自多能细胞的细胞中诱导MAFA表达的方法，所述方法包括培养多能细胞，通过用补充有选自极光激酶抑制剂、RSK抑制剂、蛋白质甲基转移酶D...

【专利技术属性】
技术研发人员：A雷扎尼亚，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US