一种产麦角甾醇内生真菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体是一种内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，所述的内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，分类命名为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)，保藏编号为CGMCC No.11305。本发明专利技术通过内生真菌菌株液体发酵，产生了麦角甾醇。本发明专利技术的丹参内生真菌是寻找麦角甾醇新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

An endophytic fungus producing ergosterol and its application

The present invention relates to the technical field of microorganisms, in particular to a endophytic fungi in the preparation of the application of ergosterol, the endophytic fungi are fungi using endogenous living Salvia plants from Labiatae in separation and purification technology of isolation, classification and nomenclature of spherical Phoma D14 (Phoma glomerata). The preservation number is CGMCC No.11305. The present invention by endophytic fungi fermentation, produce ergosterol. The invention of Salvia endophytic fungi is an important microorganism for ergosterol of new resources, and has great application value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，具体地说，是一种产麦角甾醇的内生真菌及其应用。
技术介绍
维生素D2是哺乳动物生长发育所必需的脂溶性维生素，其主要生理功能是调节体内钙磷代谢。在医药工业上，维生素D2是预防和治疗佝偻病、龋齿及老年骨质疏松症的重要药品。麦角甾醇存在于酵母和一些植物中，是脂溶性维生素D2的前体，在紫外线照射下，转化为维生素D2。从酵母细胞中提取麦角甾醇，然后用紫外线照射是生产维生素D2的主要方法。此外，麦角甾醇还是一种重要的医药化工原料，可用于“可的松”、“黄体酮”等药物的生产。自从Tanret首次从麦角中分离到麦角甾醇以来，研究者们试图通过生物技术方法获得麦角甾醇，随后便开始了对其分离、测定和高产菌株选育等方面的研究。目前，国内外用于生产麦角甾醇的酵母菌种主要采用以下选育方法获得：一是自然选育，对不同酵母菌种进行筛选，从中选出细胞麦角甾醇含量相对较高的菌种用于生产。二是采用细胞杂交选育技术，将细胞麦角甾醇含量较高的酵母细胞与细胞生物量高的酵母细胞进行杂交，从杂交子代中筛选细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的杂交子代菌株。三是采用诱变育种技术。由于常规的物理、化学等方法诱变随机性较大，麦角甾醇高产菌的筛选又无快速简便的初筛手段，且麦角甾醇含量测量非常费时，所以诱变育种的菌株选育工作量非常大。四是原生质体融合技术。此方法可以突破杂交法的一些局限性，使具有不同优良性状的单倍体菌株进行融合，获得优于亲本的融合子。中国专利技术专利ZL200410032719.X公开了一株产麦角甾醇酵母工程菌及其选育方法与应用，是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH－88CGMCCNo.1117，其选育方法包括：1)以啤酒酵母染色体DNA为模板，进行PCR扩增，得到编码甾醇C－24(28)还原酶的ERG4基因；2)将PCR扩增得到的ERG4基因连接到载体质粒上，构建含有ERG4基因的重组质粒；3)用重组质粒转化酵母菌株，筛选转化子，获得高产麦角甾醇的酵母工程菌株。专利技术所提供的生产麦角甾醇的方法，是对产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH－88CGMCCNo.1117进行发酵，获得麦角甾醇。发酵培养条件简单，成本低廉，麦角甾醇产量高，具有实用性强、操作简便等优点，易于普遍推广，具有广阔的实际应用前景。中国专利文献CN104694401A公开了一种麦角甾醇5,8过氧化物的生产用菌株，该菌株LPPV001为纯绿青霉Penicilliumverrucosum，保藏号为CGMCCNO.4468，可以通过发酵产生麦角甾醇5,8过氧化物且产率极高，经简单提纯即可得到麦角甾醇5,8过氧化物纯净物。但是关于一种能够通过微生物发酵产生麦角甾醇的丹参内生真菌及其应用目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够通过微生物发酵产生麦角甾醇的内生真菌及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种内生真菌，命名为球状茎点霉D14(Phomaglomerata)。所述的内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为球状茎点霉D14(Phomaglomerata)。该菌株已保藏，保藏号为CGMCCNo.11305，保藏日期2015年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。本专利技术所述的内生真菌的固体培养特征为：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上28℃培养，生长缓慢，菌落圆形，平坦，最初为白色，渐变为边缘白色，中间灰褐色，绒状，边缘整齐，背面蓝黑色，见图1。本专利技术所述的内生真菌的液体培养特征为：(1)培养基PDB，摇瓶培养7天，培养温度28℃；(2)发酵培养特征：培养第1天有少许1-2mm白色菌丝球出现，培养液澄清；培养第2天，菌丝球数量变多，直径增大至3-4mm，培养液澄清；培养第3天，菌丝球明显增多，直径增大至5-6mm；培养第4天，菌丝球开始变黑，培养液也变黑；培养第5天，菌丝球已经明显全部变黑；培养第6天和第7天，菌丝球与第5天没有明显差别，见图2。本专利技术所述的内生真菌形态特征为：培养的菌丝体无色、没有分枝，粗1.2-1.6um，平滑，由没有横隔，多核的菌丝体构成。本专利技术所述的内生真菌的ITS和5.8SrDNA碱基序列如SEQIDNO.1所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。同球状茎点霉PhomaglomerataAY183371，同源性100％。本专利技术的第二方面，提供上述内生真菌在制备麦角甾醇中的应用。所述的麦角甾醇是采用所述的内生真菌通过液体发酵制备得到。所述的液体发酵培养基是马铃薯液体培养基(PDB)，所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水麦角甾醇，别名：麦角固醇，英文名：ergosterol，分子式：C28H44O，CAS：57-87-4，化学结构式如下：本专利技术所述的内生真菌，经发酵可得麦角甾醇，其工艺步骤如下：菌种活化→种子培养→发酵培养→发酵产物甲醇匀浆→超声提取→减压浓缩→HPLC分析→薄层制备分析→麦角甾醇。其中，发酵原料为马铃薯液体培养基(PDB)，发酵方式为液体摇瓶培养；菌种活化采用平板固体培养基，培养基为PDA；种子培养为马铃薯液体培养基(PDB)；发酵培养基为马铃薯液体培养基(PDB)。培养时间：菌种平板培养活化72小时，种子液摇床培养72小时，发酵培养7天。培养温度：平板活化、种子摇床培养和发酵培养均为28℃。摇床转速：种子摇床培养和发酵培养均为180rpm。发酵物提取：发酵完毕，收集菌丝体，甲醇重悬，匀浆，超声提取，过滤，减压浓缩即得发酵物提取物，甲醇溶解，与标准品保留时间及紫外吸收光谱对照，明确该提取物含麦角甾醇，进一步采用外标一点法进行含量测定，确定提取物中麦角甾醇含量为10mg/g(1.0％)。同时，采用薄层制备法进行制备，经核磁波谱解析鉴定化合物结构为麦角甾醇。本专利技术的第三方面，提供采用上述内生真菌经液体发酵制备麦角甾醇的方法，包括以下步骤：(A)取本专利技术的内生真菌菌种，在无菌条件下，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，所述的内生真菌的分类命名为球状茎点霉D14(Phoma glomerata)，保藏编号为CGMCC No.11305。

【技术特征摘要】
1.一种内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，所述的内生真菌
的分类命名为球状茎点霉D14(Phomaglomerata)，保藏编号为CGMCC
No.11305。
2.根据权利要求1所述的内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，
所述的麦角甾醇是采用所述的内生真菌通过液体发酵制备得到。
3.根据权利要求2所述的内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，
所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。
4.根据权利要求3所述的内生真菌在制备麦角甾醇中的应用，其特征在于，
所述的麦角甾醇的制备方法包括以下步骤：
(A)取所述的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接
入已灭菌的固体马铃薯培养基试管，于28℃活化培养7...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑承剑，秦路平，李秀清，韩婷，辛海量，张巧艳，蒋益萍，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31