用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法技术

本发明专利技术提供了包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物，包含该免疫原性复合物的组合物，以及其作为免疫应答刺激剂和疫苗用于治疗感染性疾病、肿瘤和过敏的用途。同样地，本发明专利技术涉及基于通过使用二醛而使得抗原和甘露聚糖同时聚合和缀合来获得所述的免疫原性复合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及包含聚合抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物，包含该免疫原性复合物的组合物，以及其作为免疫应答刺激物和疫苗的用途。同样地，本专利技术涉及使用二醛，基于抗原和甘露聚糖同时进行聚合和缀合而获得所述的免疫原性复合物的方法。因此，本专利技术属于免疫学和疫苗生产领域的范围内，以及治疗和预防过敏反应的领域范围内。
技术介绍
树突状细胞(DC)是专门高效地刺激T细胞的抗原呈递细胞，并且鉴于此，它们基本用于诱导特异性免疫应答。未成熟的DC策略性地分布于组织和器官中，其中它们作为哨兵，在它们的微环境中不断地取得抗原样品。作为对不同刺激(包括抗原本身、微生物有机体的产物以及组织危险物信号)的应答，DC开始成熟过程，这使得DC在周围携带由它们本身所负载的抗原迁移至次级淋巴器官的T区。在此，显示HLA-II和共刺激分子表达增多的成熟DC与T细胞相互作用，将抗原性的肽(经DC加工后)呈递给T细胞，并刺激T细胞开始特异性的应答。未成熟的DC通过受体介导的内吞作用、微胞钦作用和吞噬作用捕获抗原。有多种不同的受体与内吞摄入有关，其中发现了甘露糖受体(MR)(CD206和CD209)。它们通过碳水化合物识别结构域而识别末端甘露糖残基、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。天然配体包括细菌来源的产物(糖蛋白和糖脂)，以及具有高的甘露糖含量的哺乳动物糖蛋白。MR在巨噬细胞和未成熟的DC中表达，与甘露糖基化的抗原的内吞作用有关，用于其加工和T细胞呈递。在IgE抗体介导的过敏状况中，免疫治疗是以给予治疗疫苗为基础的，这些疫苗抗原与过敏患者所敏感的那些为相同的变应原。变应原为得自于花粉、尘螨、上皮细胞等的蛋白质，它们是患者所呼吸(环境吸入器)的空气中所携带的超级结构。广泛接受的是，这些疫苗的临床功效与所传递的变应原的剂量有关，这样WHO和得自于科学社会的共同指导原则建议应该使用足够的变应原浓度来制备疫苗。这种要求意味着患者对疫苗剂量的过敏反应涉及不利作用的风险，而根据规定所述的作用应该受到限制。避免这种风险的方式在于基于改性的变应原(类变应原)来制备疫苗，其中所述的变应原显示出针对IgE抗原的较低的反应能力(较低的变应原性)。基于使用甲醛和/或戊二醛来处理变应原的化学修饰在疫苗制造商中最广泛地使用。醛基(R-CHO)与存在于变应原氨基酸中的氨基(R-NH2)(例如赖氨酸)的反应是此类修饰的基础。与甲醛(其为单醛)相反，戊二醛为具有2个R-CHO基的二醛，其中所述的R-CHO基能够与不同分子中存在的赖氨酸R-NH2反应。这导致变应原聚合，以及与特异性IgE抗体(通过甲醛形成的类变应原是基于蛋白质的结构修饰，而不是基于它们的聚合)的反应性受损。由于IgE抗体失去了与它们的抗原决定簇(变应原结合位点)反应的可及度，并减少了IgE致敏的肥大细胞(其被IgE所活化)的数量，所以认为这种聚合确定了类变应原较低的变应原性。聚合的变应原的变应原性损失可以意味着免疫原性损失，这可以降低这些制备物的临床功效。已经表明聚合会降低DC中MR与变应原甘露糖残基的接近，以及这对于聚合的变应原的免疫原性损失而言是决定性的。这由以下事实所支持：就变应原摄入而言，甘露糖残基为DC所用的主要配体之一，并且这些细胞在将变应原呈递给应答T细胞中起重要的作用。用于将糖与蛋白质缀合的方法主要基于通过氧化过程来活化糖，从而通过cis-乙二醇基的转化而生成反应性醛基(R-CHO)。在使用例如高碘酸盐处理后在氧化的糖中生成的R-CHO可以与赖氨酸的ε-氨基反应，从而形成Schiff碱。由于它们的碳水化合物残基用于缀合并避免了与其生物学活性有关的蛋白质部分，所以这种方法学非常适用于缀合糖蛋白(例如酶、抗体)。尽管使用高碘酸盐的糖氧化也已经报告为对蛋白质(包括变应原(Weinbergeretal.2013.JControlRelease,165:101-109))进行甘露糖基化的方式(Masarovaetal.2002.Int.J.Polymer.Anal.Charact.,7:106–116)，但是将聚合的抗原进行甘露糖基化的使用具有2个主要的缺点：a)糖的氧化使得相邻的碳原子之间的键产生了断裂，其中所述的碳原子包含羟基(OH)并且为反应性醛生成的基础。所述的断裂影响了甘露糖的结构(Shibuya,N.,etal.1988.J.Biol.Chem.,263:728-734)，从而改变了其结合识别甘露糖的凝集素的能力(Masarovaetal.2001,Chem.Pap.55:130-135)，及其DC活化能力(Shengetal,2006.Immunology,118:372–383)。尽管甘露糖结构整体性的损失可以通过降低氧化程度而减小至最低(Masarovaetal.2001,Chem.Pap.55:130—135)，但是在轻度条件下的缀合效率服从于待甘露糖基化的蛋白质的本性(Weinbergeretal.2013,J.ControlRelease,165:101-109)。为了保护天然形式的甘露糖，已经试图在高温下通过糖基化来实施蛋白质的甘露糖基化，但是在氧气缺乏下，结果为阴性(Kanskaetal.2008.Biotechnol.Appl.Biochem.49:57–64)。b)在氧化后活化的甘露糖生成了反应性醛，其必须与待甘露糖基化的蛋白质的游离氨基反应。但是，蛋白质与戊二醛的聚合使得这些氨基急剧减少，因为它们已经用于它们与戊二醛本身的反应中。在这些条件下，经活化用于将蛋白质(之前使用戊二醛处理过)甘露糖基化的甘露糖的效率可能极低，这是因为当缺乏甘露糖可以结合的氨基时，其为戊二醛的聚合能力(Silvaetal.2004.FoodTechnol.Biotechnol.42:51–56)。这种不便性不仅影响聚合的变应原的甘露糖基化，而且影响与戊二醛(最终认为其可以被甘露糖基化)聚合的任何蛋白质的甘露糖基化。Patterson等人1977(JAllergyClinicalImmunology59:314-319)描述了变应原与戊二醛的聚合(禾本科花粉)。由于聚合的变应原显示IgE抗体致敏的肥大细胞的活化能力降低，所以聚合的变应原是低变应原的。Subiza等人2008(ClinicalandExperimentalAllergy,39:987-994)描述了用于过敏中免疫治疗的戊二醛(也称为类变应原)修饰的变应原(禾本科花粉、Trisetumpa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.03 ES P2013304741.一种包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物。
2.根据权利要求1所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖得自
植物、真菌或酵母菌。
3.根据权利要求2所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母菌选自酵
母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。
4.根据权利要求3所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母属物种为
酿酒酵母。
5.根据权利要求1至4的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述
的甘露聚糖包含氨基。
6.根据权利要求5所述的免疫原性复合物，其中所述的氨基存在于赖
氨酸氨基酸中。
7.根据权利要求1至6的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述
的聚合的抗原包含至少2个抗原，它们是彼此相同的或不同的。
8.根据权利要求1至7的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述
的二醛选自戊二醛,乙二醛,丙二醛,丁二醛和己二醛。
9.根据权利要求8所述的免疫原性复合物，其中所述的二醛为戊二醛。
10.根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所
述的聚合的抗原通过所述的戊二醛与所述的甘露聚糖结合。
11.根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所
述的抗原通过所述的聚合的抗原通过物理诱捕而与所述的甘露聚糖结合。
12.根据权利要求1至11的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所
述的抗原为变应原。
13.根据权利要求12所述的免疫原性复合物，其中所述的变应原选自
花粉、虫螨、上皮细胞、真菌孢子和它们的组合。
14.根据权利要求13所述的免疫原性复合物，其中所述的花粉选自物
种梯牧草、喜马拉雅鸭茅、狗牙根、多年生黑麦草、三毛草属、橄榄、
Cuppresusspp.、豚草属、桦木属、悬铃木属、欧榛或欧洲桤木。
15.根据权利要求13或14所述的免疫原性复合物，其中所述的虫螨
属于物种欧洲室尘螨、美洲尘螨或Blomiatropicalis。
16.根据权利要求13至15的任意一项所述的免疫原性复合物，其中
所述的上皮细胞属于物种Felisdomesticus或家犬。
17.根据权利要求13至16的任意一项所述的免疫原性复合物，其中
所述的真菌孢子属于物种烟草赤星病菌或细链格孢。
18.根据权利要求1至17的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所
述的抗原：甘露聚糖的比例范围为1:10至1:0.1，优选为1:0.3或1:0.5。
19.根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物，其包括
(i)制备包含抗原和甘露聚糖的溶解物；以及(ii)将所述的二醛加入至
所述的溶解物中。
20.权利要求19所述的方法，其包括步骤(iii)：包括加入中和试剂，
优选为甘氨酸，从而终止所述的聚合反应。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其还包括步骤(iv)：分离所
述的免疫原性复合物。
22.根据权利要求19至21的任意一项所述的免疫原性复合物，其中
所述的甘露聚糖得自植物、真菌或酵母菌。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的酵母菌选自酵母属、毕
赤酵母属和假丝酵母属。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·L·苏维萨加里多莱斯塔切，J·卡那达维西奈，I·索里亚卡斯特罗，E·费尔南德斯卡尔达斯罗德里格斯，A·曼扎诺佩雷斯，B·卡瑟斯奥尔特加，J·吉梅内斯巴贝罗，M·卡萨诺瓦斯弗格斯，
申请(专利权)人：尹姆诺泰克公司，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES