本发明专利技术公开一种只在昆虫中具有的多结构域内切几丁质酶、其生物材料及其应用，通过大量实验证明该几丁质酶在水解几丁质过程中能够使几丁质底物变得蓬松，具有特殊的作用方式，目前在其它种类的几丁质酶中还没有被发现。其特殊的作用方式可用于几丁质寡糖的生产，与其它几丁质酶协同作用可以实现对几丁质的高效水解，其产物在医学、食品、能源、农业等领域具有广泛的应用前景，具有重要的意义和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种昆虫来源的多结构域内切几丁质酶、其相关的生物材料及其应用。
技术介绍
几丁质是由β-N-乙酰氨基葡萄糖通过β-(1,4)糖苷键聚合而成的直链线性高聚物，主要存在于真菌细胞壁，虾蟹壳以及昆虫的外骨骼中。它是在自然界中含量仅次于纤维素的天然多糖，年产量至少100亿吨，是重要的可再生能源。其衍生物及水解产物几丁质寡糖具有抗菌、抗肿瘤等活性，在医学、食品、能源、农业等领域具有广泛的应用前景。自然界中，几丁质的降解主要是由属于18家族糖苷水解酶的几丁质酶实现的。其主要分布在以几丁质为碳源的微生物以及将几丁质作为结构成分的真菌，甲壳类动物和昆虫中。研究发现，几丁质酶可以分为内切几丁质酶和外切几丁质酶两类，内切几丁质酶能够随机的切断几丁质糖链，而外切几丁质酶能够从一端切割几丁质糖链。目前研究的几丁质酶多数对于酸碱热处理后的胶体几丁质具有较高的活性。通过内切和外切几丁质酶的协同作用就可以实现几丁质的高效水解。然而，天然的几丁质结构是十分致密的，几丁质酶只能作用在几丁质的表面，效率很低，并不能破坏几丁质的致密结构，这严重的影响了几丁质的水解效率。通过酸碱热处理的方法尽管能够使几丁质变蓬松，但是存在需要消耗大量的能源且污染环境的问题。如何将结构致密的几丁质变蓬松，使几丁质链释放出来，有利于几丁质酶的水解，是几丁质的降解过程中面临的难题。
技术实现思路
通过蛋白质组学研究，申请人发现昆虫负责降解表皮几丁质的蜕皮液中存在一种独特的几丁质酶ChtII。它的一个酶分子中具有多个几丁质结合结构域和催化结构域，与已知报道的具有几丁质降解活性的酶具有很大的差别。它水解几丁质能够使几丁质的致密结构变得蓬松，这种昆虫中特有的新型几丁质酶对于开发利用几丁质资源具有重要意义。首先，本专利技术公开一种蛋白质，具体是一种昆虫来源的多结构域内切几丁质酶，其为1a)～4a)中的一种：1a)具有如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示氨基酸序列的蛋白质；2a)在SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；3a)将SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示的氨基酸序列经过1个、2个、3个、4个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；4a)含有序列表中SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示的氨基酸序列的具有相同功能的蛋白质。本专利技术的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。本专利技术提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述1b)-4b)中的任一种；1b)编码上述蛋白质的核酸；2b)含有1b)所述核酸分子的表达盒；3b)含有1b)所述核酸分子的重组载体或含有2b)所述表达盒的重组载体；4b)含有1b)所述核酸分子的重组菌或含有2b)所述表达盒的重组菌或含有3b)所述重组载体的重组菌。本专利技术另一个目的是提供一种上文所述相关生物材料中，1b)所述核酸分子为如下1c)、2c)或3c)的DNA分子：1c)如SEQIDNO.2、SEQIDNO.5或SEQIDNO.7所示的DNA分子；2c)与1c)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性编码所述蛋白质的DNA分子；3c)在严格条件下与1c)或2c)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。优选的情况下，本专利技术上文4b)所述的重组菌是将氨基酸序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示的几丁质酶的编码基因导入宿主菌中得到的，本专利技术上文所述重组菌中，所述几丁质酶的编码基因是通过重组载体导入宿主菌的；本专利技术上文所述重组载体是将编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子插入表达载体，得到表达权利要求1所述蛋白质的载体；本专利技术实施例中选用的表达载体是pPIC9。本专利技术上文所述几丁质酶的编码基因的序列如序列表中SEQIDNO.2、SEQIDNO.5或SEQIDNO.7所示。本专利技术上文所述重组菌中，所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115.本专利技术的另一个目的是提供一种制备几丁质酶方法。本专利技术提供的制备几丁质酶方法包括如下步骤：发酵培养上述重组菌，得到几丁质酶。上述蛋白质在作为几丁质酶中的应用也属于本专利技术的一个目的。本专利技术还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。本专利技术提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在水解固体几丁质，胶体几丁质和/或几丁寡糖的产品中的应用。本专利技术还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在制备几丁寡糖中的应用。本专利技术克隆了一种只在昆虫中具有的多结构域内切几丁质酶基因并进行了异源表达、重组酶纯化及其性质研究，通过对截短蛋白几丁质酶ChtII-B4C1的实验证明：该几丁质酶在水解几丁质过程中能够使几丁质底物变得蓬松，具有特殊的作用方式，目前在其它种类的几丁质酶中还没有被发现。由于全长ChtII比截短蛋白几丁质酶ChtII-B4C1具有更多的几丁质结合结构域和催化结构域，因此有理由相信其全长蛋白具有比几丁质酶ChtII-B4C1更好的水解几丁质的效果。其特殊的作用方式可用于几丁质寡糖的生产，与其它几丁质酶协同作用可以实现对几丁质的高效水解，其产物在医学、食品、能源、农业等领域具有广泛的应用前景，具有重要的意义和应用价值。附图说明图1.亚洲玉米螟2家族几丁质酶ChtII的基因获取。A：同源获取PCR产物D1凝胶电泳图；B：第一次3′RACE扩增产物3-1凝胶电泳图；C：第二次3′RACE扩增产物3-2凝胶电泳图；D：第一次5′RACE扩增产物5-1凝胶电泳图；E：第二次同源获取产物D2凝胶电泳图；F：SMARTer5ˊRACE扩增产物5-2凝胶电泳图(目的条带为箭头所示)；G：第一次RACEWalking扩增产物5-3凝胶电泳图(目的条带为箭头所示)；H：第二次RACEWalkingPCR产物5-4凝胶电泳图(目的条带为箭头所示)；I：第三次RACEWalkingPCR产物5-5凝胶电泳图(目的条带为箭头所示)；J：第三次5′RACE扩增产物5-6凝胶电泳图；K：RACE验证扩增产物ChtII凝胶电泳图。图2.几丁质酶ChtII的结构域组成；图3.纯化后的重组蛋白几丁质酶ChtII-C1，几丁质酶ChtII-B4C1的电泳图；图4.几丁质酶ChtII-C1对pNP-(GlcNAc)2底物的最适pH；图5.几丁质酶ChtII-C1对pNP-(GlcNAc)2底物的最适温度；图6.几丁质酶ChtII-C1对pNP-(GlcNAc)2底物的酶动力学曲线；图7.几丁质酶ChtII-C1，ChtII-B4C1对胶体几丁质底物的酶动力学双倒数曲线；图8.几丁质酶ChtII-C1，ChtII-B4C1对胶体几丁质底物的朗缪尔等温吸附曲线；图9.几丁质酶ChtII-C1，ChtII-B4C1对胶体几丁质底物水解随时间变化；图10.几丁质酶ChtII-B4C1对固体几丁质底物水解随时间变化；CK：对照；图11.几丁质酶ChtII-B4C1对固体几丁质底物水解后的扫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质，其特征在于：为1a)～4a)中的一种：1a)具有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的蛋白质；2a)在SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；3a)将SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；4a)含有序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的具有相同功能的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，其特征在于：为1a)～4a)中的一种：1a)具有如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示氨基酸序列的蛋白质；2a)在SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；3a)将SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；4a)含有序列表中SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示的氨基酸序列的具有相同功能的蛋白质。2.一种如权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于：为下述1b)～4b)中的一种；1b)编码权利要求1所述蛋白质的核酸；2b)含有1b)所述核酸分子的表达盒；3b)含有1b)所述核酸分子的重组载体或含有2b)所述表达盒的重组载体；4b)含有1b)所述核酸分子的重组菌或含有2b)所述表达盒的重组菌或含有3b)所述重组载体的重组菌。3.根据权利要求2所述的蛋白质相关生物材料，其特征在于：1b)中所述核酸分子为1c)、2c)或3c)中的一种：1c)如SEQIDNO.2、SEQIDNO.5或SEQIDNO.7所示的DNA分子；2c)与1c)限定的DNA序列至少...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨青，屈明博，邓晓瑞，陈威，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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