本发明专利技术公开猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白，按照大肠杆菌密码子使用的偏好性来设计VP1基因对应的核苷酸序列，通过人工方法合成相应的核苷酸序列，通过PCR得到其P结构域基因P‑RGD及变体基因P△R，然后将得到的各双链核苷酸基因片段通过无缝连接的方式插入到带有GST标签的原核表达载体pGEX‑4T‑1中，构建成重组质粒，再转化大肠杆菌BL21，用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，通过GST亲和柱纯化诱导表达的蛋白，最终得到P结构域蛋白P‑RGD及变体蛋白P△R，并通过免疫印迹法验证了表达的蛋白具有抗原性，可以作为开发诺如病毒检测试剂盒的原料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白，以及纯化方法和应用。
技术介绍
诺如病毒(Norovirus,NoV)是导致成人和儿童非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，是近年来导致人类由腹泻引起的发病率和死亡率增高的主要原因，诺如病毒可在所有年龄段、不同场所(幼儿园、学校、养老院、餐馆等)引起暴发。诺如病毒感染的特征为突然发病，呕吐、腹痛和水样腹泻，可伴有发烧和头痛等，所有年龄人群对该病毒均敏感，一般潜伏期为24h～48h，病程为2d～3d，虽然常自愈，但不断出现的新流行株仍对人类健康造成很大威胁。诺如病毒根据其RNA多聚酶区和衣壳蛋白区序列同源性差异可分为6个基因组：GI、GII、GIII、GIV、GV和GVI。其中，GI、GII、GIV主要感染人，GIII感染牛，GV感染鼠，GVI感染狗。根据ORF2全基因序列相似性，GI至少可分为9个基因型，GII至少可分为22个基因型，九十年代中期一种特异性的诺如病毒GII.4株是造成世界范围内诺如病毒流行的主要基因型，目前国内流行优势株正逐渐转变为GII.17型。诺如病毒属于杯状病毒科诺瓦克病毒属，直径约为26～35nm，无包膜，球形，呈二十面体对称，基因组为单股正链RNA，全长约为7.5kb，包含三个阅读框，ORF1长约5kb，编码非结构蛋白，经翻译后修饰成6个功能蛋白，包括：N末端蛋白(P48)、NTPase、3A样蛋白、VPg(病毒基因组连接蛋白)、3C样蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶(Pol)。ORF2长约1.8kb，编码530个左右氨基酸的衣壳蛋白(VP1)，VP1蛋白折叠成两个区域：壳区(S区)和突出区(P区)，其中S区为VP1的内壳，P区位于VP1结构的壳外，包含P1和P2两个亚区，P2亚区位于衣壳蛋白的最外层，易发生变异。ORF3长约0.6kb，编码一个微小结构蛋白(VP2)，VP2蛋白的具体功能未知，有研究认为它可能参与病毒衣壳的构建，并有助于整个衣壳蛋白的稳定。由于诺如病毒目前还无法在体外进行培养，因此基因工程方法是目前诺如病毒疫苗研发的唯一方法。诺如病毒编码结构蛋白VP1可形成类病毒颗粒(vires-likeparticles，VLPs)，其在形态和抗原方面与天然的病毒相似，是宿主识别和发生免疫应答的主要位点，是诺如病毒的重要候选疫苗之一。然而，制备VLPs需要在真核系统中才能很好地形成颗粒，这种方法非常复杂且产量不是很高。研究表明，诺如病毒的P结构域在大肠杆菌中表达后，能自然形成P颗粒，具有很好地抗原性和免疫原性。原核表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统，也是基因工程中应用最广泛的表达系统，该项技术主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导并最终纯化获得所需目的蛋白，其优点在于操作简单，能够在较短时间内获得基因表达产物，所需成本相对比较低廉，外源基因表达产物水平高，基因背景和表达特性清楚。由于诺如病毒基因变异性大导致诺如病毒的暴发流行，有必要通过原核系统研发诺如病毒的疫苗，并开发病毒感染检测试剂盒。
技术实现思路
为解决现有技术不能有效预防诺如病毒的暴发问题，本专利技术提供猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白，通过分别构建含中和位点和受体结合位点的诺如病毒P结构域P-RGD及变体蛋白P△R，只需1次免疫注射该蛋白即可诱导小鼠产生较高低度的抗体，可用于后续GII.17型诺如病毒感染的检测及疫苗研发。本专利技术通过下列技术方案实现：猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQIDNo.1所示。上述猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其氨基酸基因序列如SEQIDNo.2所示。猴源GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQIDNo.3所示。上述GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白，其氨基酸基因序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术的另一目的还在于提供上述猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白在GII.17型诺如病毒感染检测和疫苗制备上的应用。具体地，可以用目的蛋白包被ELSIA板，检测疑似诺如病毒感染的病人血清。上述猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白，是经过下列步骤得到：(1)将pGEX-4T-1质粒用BamHI和NotI进行双酶切，1％琼脂糖核酸胶酶切后进行基因回收，得到含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒；(2)将腹泻猴子的粪便制成悬液，通过RT-PCR技术及测序获得猴源GII.17诺如病毒VP1基因序列，按照大肠杆菌密码子使用的偏好性优化VP1蛋白的核苷酸序列，人工合成VP1基因；以此基因为模板，通过如下P-RGD引物和PΔR引物进行PCR扩增，分别得到含RGD序列的P结构域基因(P-RGD)和不含精氨酸聚合区的P结构域变体(PΔR)基因，即带酶切位点的两个质粒P-RGD、P△R：P-RGD引物F：tctggttccgcgtggatcctctaaaaccaaaccR：1、gcagaagcagtcaccacggcagtcgcactgcgcacgacgg2、cagtcagtcacgatgcggccgcttagcagaagcagtcaccacPΔR引物F：tctggttccgcgtggatcctctaaaaccaaaccR：cagtcagtcacgatgcggccgcttacccattcccggtgc扩增后的基因片段纯化后通过无缝拼接分别克隆进入步骤(1)的含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒，得到两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST；(3)将步骤(2)得到的两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证；(4)将步骤(3)测序验证正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(市购)，经过菌落PCR扩增(扩增所使用的引物同步骤2的引物，扩增是为了初步鉴定质粒构建是否成功)，鉴定质粒构建成功后，即得到P-RGD-GST、PΔR-GST表达克隆子；(5)利用IPTG诱导步骤(4)得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表达克隆子，得到高效表达的P-RGD-GST、PΔR-GST目的蛋白，用超声方法对目的蛋白进行细胞壁破碎，经离心，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定各蛋白存在形式，用GST亲和纯化柱对P-RGD-GST、PΔR-GST重组蛋白进行纯化，用Thrombin酶切掉GST标签，纯化后分别得到P-RGD和PΔR目的蛋白。所述步骤(2)的猴源GII.17诺如病毒VP1基因序列的基因库收录号为：KX356908。所述步骤(2)的人工合成VP1基因是5，端和3，端分别含有限制性内切酶BamHI和NotI酶切位点序列。所述步骤(2)的P-RGD引物有两段下游引物，首先将上游和下游引物1进行PCR扩增，扩增后产物再用上游引物和下游引物2进行PCR扩增。所述步骤(2)的无缝拼接是将带酶切位点的两个质粒P-RGD和P△R各取50纳克，分别与100纳克含G本文档来自技高网...
【技术保护点】
猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其特征在于：其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其特征在于：其核苷酸基因序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其特征在于：其氨基酸基因序列如SEQIDNo.2所示。3.猴源GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白，其特征在于：其核苷酸基因序列如SEQIDNo.3所示。4.根据权利要求上述GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白，其特征在于：其氨基酸基因序列如SEQIDNo.4所示。5.权利要求1或2所述猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白或者权利要求3或4所述猴源GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白在GII.17型诺如病毒感染检测和疫苗制备上的应用。6.猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白的制备方法，其特征在于经过下列步骤得到：（1）将pGEX-4T-1质粒用BamHI和NotI进行双酶切，1%琼脂糖核酸胶酶切后进行基因回收，得到含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒；（2）将腹泻猴子的粪便制成悬液，通过RT-PCR技术及测序获得猴源GII.17诺如病毒VP1基因序列，按照大肠杆菌密码子使用的偏好性优化VP1蛋白的核苷酸序列，人工合成VP1基因；以此基因为模板，通过如下P-RGD引物和PΔR引物进行PCR扩增，分别得到含RGD序列的P结构域基因和不含精氨酸聚合区的P结构域变体基因，即带酶切位点的两个质粒P-RGD、P△R：P-RGD引物F：tctggttccgcgtggatcctctaaaaccaaaccR：1、gcagaagcagtcaccacggcagtcgcactgcgcacgacgg2、cagtcagtcacgatgcggccgcttagcagaagcagtcaccacPΔR引物F：tctggttccgcgtggatcctctaaaaccaaaccR：cagtcagtcacgatgcggccgcttacccattcccggtgc扩增后的基因片段纯化后通过无缝拼接分别克隆进入步骤（1）的含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒，得到两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST；（3）将步骤（2）得到的两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证；（4）将步骤（3）测序验证正确...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红旗，刘波，李超，陶玉芬，刘建生，李昕潼，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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