本发明专利技术公开一种促进人参皂苷转运与积累相关基因PgPDR3及其编码蛋白和应用。该人参皂苷转运与积累相关基因PgPDR3序列如SEQ?ID?NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ??ID?NO.2所示。研究发现PgPDR3基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累密切相关。所述PgPDR3基因在促进人参皂苷合成、转运和积累方面有显著的效果。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参及其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参转基因细胞或植物生产原人参二醇、Rb、Re、Rh2、Rg2和Rg3等人参皂苷单体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程
，涉及改良植物性状，具体是促人参皂苷生物合成、转运与积累的相关基因及其蛋白和应用。本专利技术在提高人参等植物中人参皂苷含量方面有着重要的应用价值。
技术介绍
人参(P. ginseng C. A. Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,是名贵中药材。人参中含有多种药用成分，其中人参皂苷是人参最主要的活性成分。目前已从人参根中分离出50余种人参皂苷，现代医学研究证明各皂苷单体具有重要的药用价值，且已广泛应用于临床。但是其中一些具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性强的皂苷含量极低。近年来，国内外对利用人参细胞培养等技术生产人参皂苷进行了广泛和深入的研究，但其含量仍较低，远不能满足市场的需求。在植物次生代谢调控中，可以通过导入关键酶等基因调控合成途径中的多步限速反应，并促进次生代谢产物的合成；或通过诱导跨膜转运蛋白将合成的代谢产物转运到细胞外或细胞器中得以积累，利用转运系统使合成代谢向积累方向转变，从而提高次生代谢产物含量。通过人参皂苷的转运机制，进而促进人参皂苷合成与积累，有望成为人参皂苷高产调控的新策略。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)转运蛋白是目前已知最大，功能最广泛的蛋白家族，ABC转运蛋白属于跨膜运输蛋白，利用水解ATP释放的能量转运有机酸、生物碱、细胞代谢产物和药物等。参与细菌耐药性、次生代谢产物积累、胁迫反应和肿瘤抗药性等。ABC转运蛋白家族包括多向耐药性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多药耐药性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亚族,是植物和真菌中特有的一种ABC转运蛋白。但目前对植物PDR基因相关研究甚少，离体细胞培养中，香紫苏醇可诱导NpTORl基因上调表达，在细胞内NpTORl蛋白累积增强了细胞向胞外转运香紫苏醇以及其类似物的能力。拟南芥(A. thaliana)细胞内香紫苏醇的累积亦能诱导AtH)R12基因上调表达，同时在细胞外检测到AtH)R12蛋白向胞外转运的香紫苏醇，推测萜类物质可能是AtH)R12基因表达的上游调控物质。因此，PDR蛋白可能通过转运内源性抗真菌二萜类物质参与植物防御反应。此外，尚无植物PDR蛋白转运更复杂萜类分子的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种能够调控人参皂苷转运与积累相关的基因、由该基因编码的蛋白及其应用，为今后开发基因工程产品奠定基础。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为本专利技术提供了一种人参PgPDR3基因，基因序列如SEQ ID NO. I所示。本专利技术还提供了一种用于扩增PgPDR3基因的简并引物对，所述引物对如SEQ IDNO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。本专利技术还提供了含有PgPDR3基因重组载体，具体包括植物表达载体PBI121，gp，将PgPDR3基因克隆到空载体PBI121中，获得重组载体pBI121_PgPDR3 ;原核表达载体pET28a，即，将PgPDR3基因克隆到空载体pET28a中，获得重组载体pET28a-PgPDR3。PgPDR3基因亦可克隆到其他空载体中，或制备成转基因细胞及重组菌。本专利技术还提供了 PgPDR3基因在调控人参皂苷转运与积累中的应用；PgPDR3基因在人参育种中的应用。本专利技术还提供了一种由SEQ ID NO. I所不PgPDR3基因编码的蛋白，该蛋白的序列如 SEQ IDN0. 2 所示。 本专利技术还提供了 SEQ ID NO. 2所示蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用，以及该蛋白在人参育种中的应用。本专利技术利用现有的植物基因工程技术，利用植物PDR基因同源性设计简并引物，利用cDNA-AFLP及RACE技术，分离与鉴定人参皂苷转运与积累相关的基因序列，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过异源表达鉴定证明PgPDR3基因对人参皂苷的转运功能。本专利技术人参ABC转运蛋白基因PgPDR3序列如SEQ ID NO. I所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。研究发现PgPDR3基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累有关。初步表明所述PgPDR3基因具有促进人参皂苷合成、转运和积累方面的功能。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参甚至其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参组织培养或转基因植物生产Rb、Re和Rg等人参皂苷单体。附图说明图I是本专利技术的PCR扩增PgPDR3基因图示；图中，I表示简并引物PCR扩增产物，M 表不 Marker ；图2是本专利技术的PgPDR3蛋白跨膜结构域预测图；图3是本专利技术的PgPDR3基因编码氨基酸序列及其与其它植物PDR基因同源性比较图；图4是本专利技术的PgPDR3基因编码氨基酸序列进化树分析图；图5是本专利技术的PgPDR3基因在人参不同组织中的表达水平图；图6是本专利技术的PgPDR3基因在ΙΟΟμΜ MeJA诱导条件下的人参细胞中表达水平图。具体实施例方式实施实例I PgPDR3基因的获得I、人参悬浮细胞培养(I)取吉林长白山人参产区四年生人参根，自来水浸泡45min后冲洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒(sec)，无菌水冲洗2次，无菌室超净工作台上用O. l%HgCl2消毒，不断搅动，无菌蒸馏水冲洗4-5次。(2)在无菌条件下，将消毒过的外植体接种到含有2，4_D (2. Omg/L)和KT (O. 5mg/L)的MS培养基中。经3次继代培养后外植体完全脱分化，待完全形成愈伤组织后，每IOOml三角瓶接种6个外植体，培养条件如前述，培养45天(d)后将愈伤组织行继代培养，以补充培养物所需的营养物质和其它要求。接种30d后进行第一次继代培养，以后每3-4周继代一次。(3)当得到愈伤组织后，将其转入到MS液体培养基中。愈伤组织块直径应小于3mm。若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在50ml的锥形瓶内，每IOml液体培养基接种I. 5-2. Og愈伤组织，接种后震荡培养，120rpm, 24°C，暗培养。每隔4-7d继代一次。2、细胞处理及其RNA提取(I)细胞处理 I)取460 μ L茉莉酸甲酯(Me JA )溶于4540 μ L乙醇，加5ml双蒸水至IOml，配成IOml 200mM的MeJA母液，用O. 22 μ m的滤器过滤除菌，处理组每IOml液体培养基加入10 μ L母液至终浓度为200 μ M ;取4540 μ L乙醇加入双蒸水中定容至IOml做为对照，用O.22 μ m的滤器过滤除菌后，对照组每IOml液体培养基加入10 μ L。2)在悬浮细胞继代的48h后按以上方法处理处理组与对照组的细胞，120rpm,24°C，振荡暗培养，培养24h后分别提取处理组的对照组的人参细胞的总RNA。(2)人参悬浮细胞总RNA提取①3000 Xg离心5min收集的悬浮细胞,在研钵内用液氮充分研磨成粉末。每40mg研磨的粉末置于1.5ml离心管中，加入Iml TRIzoI试剂，40 μ L β-巯基乙醇，用移液器吸头重悬细胞沉淀，室温孵育5-10min。②加入O. 2ml氯仿，振摇15sec,室温孵育10_15min。③4°C、1200本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人参PgPDR3基因，其特征在于，所述PgPDR3基因序列如SEQ？ID？N0.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗志勇，张儒，黄景嘉，祝捷，陈湘晖，曹宏哲，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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