一种功能性分层级三维多孔硅基薄膜制备方法及其生物应用技术

本发明专利技术涉及一种功能性分层级三维介孔硅基薄膜制备方法及其生物应用。其制备方法是：借助于软模板和硬模板法来制备分层级多孔硅膜，主要工艺包括三步：(1)硬模板聚苯乙烯粒子的合成，(2)含有普兰尼克F127的硅预聚体的制备，(3)灌装溶胶，(4)去除硬模板中的聚苯乙烯粒子及普兰尼克F127；本发明专利技术制备的薄膜用于提取不同片段生物标记物DNA。本发明专利技术在于：该分层级多孔硅基薄膜制备工艺简单，可实现大规模制备，与常规的二维硅基薄膜相比，对于高浓度的生物标记物的提取，分层级多孔硅基薄膜的提取效率大大提高，为临床样本的早期诊断提供了一种新的策略。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种功能性分层级三维介孔硅基薄膜制备方法及其生物应用。具体涉及一种基于分层级三维多孔二氧化硅薄膜的制备方法及其用于生物标记物的检测，以实现临床样品的早期诊断，属于生物标记物的体外诊断领域。
技术介绍
生物标记物不仅可从分子水平探讨发病机制，而且在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警，很大程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。患者血清/血浆中的游离核酸作为一些新型的临床检测生物标记物，尤其在早期癌症检测中扮演很重要的角色。因此高效的核酸分离技术为预测，监测和治疗癌症患者提供了一个定量分析的良好手段，由于病人的情况不同以及差异性的分离提纯方法，分离得到的核酸，特异性蛋白浓度往往是重复性比较差的结果，这种分离提取技术迫切需要是一种低成本、快速、高效和可靠的方法。当前商业化的核酸分离纯化柱中，Qiagen分离柱是一种最典型的DNA分离提取试剂盒，它可从血浆、血清和其他无细胞体液中高效纯化游离核酸，重复性较好，但其售价较高，单次实验费用花费太大，至少需要花费150元，而且获取的DNA产率偏低。这种分离提取技术迫切需要是一种低成本、快速、高效可靠的方法。临床样本的生物标志物的提取效率高度依赖材料的比表面积和孔道的通量体积。介孔纳米粒子和二维介孔硅基材料在提取生物标志物的过程中，由于它们的比表面积、通量体积比较小，很容易被血清/血浆中丰富的蛋白质和脂质堵住孔道，这样会大大抑制吸附效率。当前常规三维介孔硅基材料制备工艺相对复杂，在临床检测应用过程中，实际操作的灵活性稍微偏低。因此提供一种基于功能性分层级三维多孔硅基薄膜的制备方法及其用于临床样品的早期精准体外诊断具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种功能性分层级多孔硅基薄膜制备方法及其生物应用，此法能够克服常规方法的上述问题，应用此方法可以简便大规模地制备分层级三维多孔硅基薄膜，该薄膜将以核酸为目标检测物，开展无标记技术研究，为临床样本的早期诊断提供了一种新的策略。为实现本专利技术的第一个目的：本专利技术的技术方案一种功能性分层级三维多孔硅基薄膜制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)硬模板聚苯乙烯粒子的合成：a、将苯乙烯、聚醚酰亚胺及乙醇加入到烧瓶内搅拌，然后向烧瓶内通氮气，以除去反应容器里面的氧；b、加热反应体系至75℃，向其中加入偶氮二异丁腈进行聚合；c、通过离心洗涤，以除去反应中剩下的苯乙烯和聚醚酰亚胺，最后通过冷冻干燥的方式得到聚苯乙烯粒子；d、将聚苯乙烯粒子的乙醇溶液通过旋涂的方式沉积到硅片上，旋涂次数3-5次，然后将该硅片放置烘箱中于80℃恒温6h进行固化，得到硬模板聚苯乙烯粒子；(2)含有普兰尼克F127的硅预聚体的制备：将普兰尼克F127的乙醇溶液、正硅酸乙酯、盐酸溶液加入到玻璃瓶中搅拌，得到硅预聚体；(3)灌装溶胶将硅预聚体通过旋涂的方式浸润整片硬模板，旋涂次数2-5次，室温晾干；(4)去除硬模板中的聚苯乙烯粒子及普兰尼克F127采用马弗炉高温煅烧法去除硬模板中的聚苯乙烯粒子和普兰尼克F127，2℃/min的速度升温至500℃，并恒温4h，然后以2℃/min的速度降温至室温，留在基片上多孔有序结构即为三维多孔硅基薄膜。上述方案中，所述的三维多孔硅基薄膜大孔孔径大小为1μm，介孔大小为6nm。上述方案中，所述的普兰尼克F127和乙醇的质量比为1：10—3:10，盐酸的浓度是1M，正硅酸乙酯和盐酸的体积比为1：1。上述方案中，所述聚苯乙烯粒子沉积到硅片上的旋涂速度是350rpm，旋涂时间为120秒。上述方案中，所述硅预聚体沉积到硅片上的旋涂速度是2000rpm，旋涂时间为20秒。上述方案中，所述聚醚酰亚胺与乙醇的质量比为1：100—5：100，偶氮二异丁腈与苯乙烯的质量比为1：100—4:100。上述方案中，所述硬模板聚苯乙烯粒子粒径是1μm。聚苯乙烯粒子是通过分散聚合合成的：聚醚酰亚胺作为分散剂，苯乙烯作为单体，偶氮二异丁腈作为引发剂，无水乙醇作为分散溶剂。上述方案中，含有普兰尼克F127的硅预聚体的制备：正硅酸乙酯和盐酸作为反应剂，F127作为致孔的软模板，反应溶剂是乙醇。为实现本专利技术的第二个目的：本专利技术的技术方案功能性分层级三维多孔硅基薄膜制备方法制得的薄膜的应用，其特征在于：所述三维多孔硅基薄膜用于不同片段的DNA的提取。上述方案中，不同DNA碎片分别为206bp，507bp，1100bp.上述方案中，生物标记物分散的溶剂是磷酸盐生理缓冲溶液。本方面的有益效果是，该分层级多孔硅基薄膜大孔粒径为1μm，介孔粒径为6nm，薄膜制备工艺简单，可实现大规模制备，与常规的二维硅基薄膜相比，对于高浓度的生物标记物的提取，分层级多孔硅基薄膜的提取效率大大提高，为临床样本的早期诊断提供了一种新的策略。下面结合说明书附图和具体实施方式对本专利技术做进一步介绍。附图说明图1为硬模板聚苯乙烯粒子的SEM图及DLS图谱；图2为分层级三维多孔硅基薄膜的制备工艺流程图；图3为分层级三维多孔硅基薄膜的SEM、TEM及AFM图；图4为分层级三维多孔硅基薄膜对不同片段的核酸的提取。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述专利技术的内容对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如图2所示，本专利技术公开了一种功能性分层级三维多孔硅基薄膜制备方法，包括如下步骤：(1)硬模板聚苯乙烯粒子的合成：a、将13mL的苯乙烯，2.5g的聚醚酰亚胺，120g的乙醇加入到250mL的三口烧瓶内，500rpm的搅拌速度，向三口烧瓶通氮气30min，以除去反应容器里面的氧；b、加热反应体系至75℃，向其中加入0.12g的偶氮二异丁腈，然后聚合24h；c、通过离心洗涤数次，以除去反应中剩下的单体苯乙烯和分散剂聚醚酰亚胺，离心速度7500rpm，离心时间10min，最后通过冷冻干燥的方式得到聚苯乙烯粒子；d、将2％聚苯乙烯粒子的乙醇溶液通过旋涂的方式沉积到硅片上，旋涂次数3-5次，随着乙醇的挥发，聚苯乙烯粒子将自动组装在硅片上，然后将该硅片放置烘箱中于80℃恒温6h进行固化，得到硬模板聚苯乙烯粒子；如图1所示，聚苯乙烯尺寸比较均一，粒子的大小约1μm。(2)含有普兰尼克F127的硅预聚体的制备：将5mL的10％的普兰尼克F127的乙醇溶液，1mL的正硅酸乙酯，1ml的1M的盐酸溶液加入到20mL的玻璃瓶中搅拌，搅拌速度为500rpm，搅拌时间为5h，得到硅预聚体；(3)灌装溶胶将硅预聚体通过旋涂的方式浸润整片硬模板，旋涂次数2-5次，室温晾干；(4)去除硬模板中的聚苯乙烯粒子及普兰尼克F127采用马弗炉高温煅烧法去除硬模板中的聚苯乙烯粒子和普兰尼克F127，2℃/min的速度升温至500℃，并恒温4h，然后以2℃/min的速度降温至室温，留在基片上多孔有序结构即为三维多孔硅基薄膜。上述方案中，所述的三维多孔硅基薄膜大孔孔径大小为1μm，介孔大小为6nm。上述方案中，所述的普兰尼克F127和乙醇的质量比为1：10—3:10，盐酸的浓度是1M，正硅酸乙酯和盐酸的体积比为1：1。上述方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种功能性分层级三维多孔硅基薄膜制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)硬模板聚苯乙烯粒子的合成：a、将苯乙烯、聚醚酰亚胺及乙醇加入到烧瓶内搅拌，然后向烧瓶内通氮气，以除去反应容器里面的氧；b、加热反应体系至75℃，向其中加入偶氮二异丁腈进行聚合；c、通过离心洗涤，以除去反应中剩下的苯乙烯和聚醚酰亚胺，最后通过冷冻干燥的方式得到聚苯乙烯粒子；d、将聚苯乙烯粒子的乙醇溶液通过旋涂的方式沉积到硅片上，旋涂次数3‑5次，然后将该硅片放置烘箱中于80℃恒温6h进行固化，得到硬模板聚苯乙烯粒子；(2)含有普兰尼克F127的硅预聚体的制备：将普兰尼克F127的乙醇溶液、正硅酸乙酯、盐酸溶液加入到玻璃瓶中搅拌，得到硅预聚体；(3)灌装溶胶将硅预聚体通过旋涂的方式浸润整片硬模板，旋涂次数2‑5次，室温晾干；(4)去除硬模板中的聚苯乙烯粒子及普兰尼克F127采用马弗炉高温煅烧法去除硬模板中的聚苯乙烯粒子和普兰尼克F127，2℃/min的速度升温至500℃，并恒温4h，然后以2℃/min的速度降温至室温，留在基片上多孔有序结构即为三维多孔硅基薄膜。

【技术特征摘要】
1.一种功能性分层级三维多孔硅基薄膜制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)硬模板聚苯乙烯粒子的合成：a、将苯乙烯、聚醚酰亚胺及乙醇加入到烧瓶内搅拌，然后向烧瓶内通氮气，以除去反应容器里面的氧；b、加热反应体系至75℃，向其中加入偶氮二异丁腈进行聚合；c、通过离心洗涤，以除去反应中剩下的苯乙烯和聚醚酰亚胺，最后通过冷冻干燥的方式得到聚苯乙烯粒子；d、将聚苯乙烯粒子的乙醇溶液通过旋涂的方式沉积到硅片上，旋涂次数3-5次，然后将该硅片放置烘箱中于80℃恒温6h进行固化，得到硬模板聚苯乙烯粒子；(2)含有普兰尼克F127的硅预聚体的制备：将普兰尼克F127的乙醇溶液、正硅酸乙酯、盐酸溶液加入到玻璃瓶中搅拌，得到硅预聚体；(3)灌装溶胶将硅预聚体通过旋涂的方式浸润整片硬模板，旋涂次数2-5次，室温晾干；(4)去除硬模板中的聚苯乙烯粒子及普兰尼克F127采用马弗炉高温煅烧法去除硬模板中的聚苯乙烯粒子和普兰尼克F127，2℃/min的速度升温至500℃，并恒温4h，然后以2℃/min的速度降温至室温，留在基片上多孔有序结构即为三维多孔硅基...

【专利技术属性】
技术研发人员：周云龙，钱秋萍，支黎旭，
申请(专利权)人：温州生物材料与工程研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33