RGD靶向造影微泡及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种RGD靶向造影微泡及其制备方法与应用。本发明专利技术采用机械振荡法制备RGD靶向脂质微泡，光镜下本发明专利技术的RGD靶向脂质微泡大小基本一致，分布均匀，分散性较好；平均粒径为：3.71±0.58μm；平均电位为：‑37.3±3.44mV；多肽结合率为98.62％，说明靶向连接率高；本发明专利技术的微泡对于活化血小板的趋向性及粘附性明显，在光镜显微镜下可以观察到本发明专利技术的RGD靶向脂质微泡向血小板趋向游动明显，能够活化血小板上的GpⅡb/Ⅲa受体可特异性地识别该序列。本发明专利技术RGD靶向造影微泡的制备方法简单、成泡率高、靶向连接率高，生物兼容性好，可用于制备体内脏器渗血的靶向显影剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及超声造影
，具体地，涉及RGD靶向造影微泡及其制备方法与在脏器渗血超声造影诊断中的应用。
技术介绍
腹部实质脏器渗血多发生于创伤后，包括外伤、手术或微创治疗，临床上对于失血的判断主要通过患者的症状(乏力、口干等)体征(如血压降低、心率增快、睑结膜及皮肤苍白等)、实验室检查(血红蛋白、红细胞计数及红细胞压积降低等)，而由于渗血速度缓慢，在早期失血量不多的情况下，很难判断是否存在渗血及渗血的程度如何，实验室检查也存在一定的滞后性，因此多数情况下临床无法直接观察渗血，因而不易使临床医生得到足够重视，而持续渗血若得不到及时纠正和改善，同样会导致失血性休克。在腹部实质脏器创伤出血的诊断方面，常规超声、增强CT和腹腔灌洗是三大传统诊断技术，并被沿用至今，尤其是超声技术，其具备快捷、方便、无辐射、床旁操作、可反复检查等优点在临床的应用越来越广泛,尤其是血流动力学不稳定的患者。FAST(FocusedAssessmentwithSonographyforTrauma)，即创伤重点超声评估法已成为急诊创伤患者检查有无腹腔实质脏器出血最快捷、最有效的检查方法。由于超声可以敏感地显示腹腔积液而被作为创伤后首选的检查手段，但多数情况下其不能确定创伤灶及出血部位。增强CT是评价腹部实质脏器创伤较准确的方法，但对于腹部创伤灶的渗血诊断价值并不高，加之存在放射性损伤和造影剂过敏，在临床应用中也存在一定局限性。诊断性腹腔灌洗同样可以判断腹腔是否存在出血，但不能确定出血位置。数字剪影血管造影(DSA)是诊断腹部实质脏器创伤出血的关键技术，一直被作为“金标准”，然而，其难以诊断出血速度小于5ml/min的缓慢渗血。近年来发展起来的超声造影(ContrastEnhancedUltrasound，CEUS)被誉为超声技术的“第三次革命”，CEUS可以诊断腹部脏器创伤及创伤后活动性出血，但其同样很难识别创伤后的缓慢出血。而对于诊断不明确的渗血进行开腹手术也会造成不必要的损伤，从另一方面证实了可疑渗血处理的盲目性。在过去十余年的时间里，CEUS的应用逐渐增加，其较之于常规US在评价血流灌注方面有明显的优势，而这一功能是通过超声造影剂(UltrasoundContrastAgents,UCAs)来实现的。通常所说的UCAs，即超声脂质造影微泡(Microbubbles，MBs)，一般由两部分构成，一是相对稳定的气体，通常为惰性气体，构成微泡的中心部分，二是包裹气体的壳，通常是白蛋白、磷脂或聚合物。由于充气微泡在声能作用下有很强的反射信号，因此可以增强组织在声波下的反射信号，达到增强显像的目的。它可显著增强组织的声学信号，作为人体血管及组织的影像对比增强剂和血流示踪剂，大大改善了传统US缺乏良好对比度的状况，增强了超声显影效果。靶向超声造影剂(TargetedUltrasoundContrastAgents，tUCAs)是将特异性抗体或配体连接到微泡表面，依靠抗原抗体或配体受体之间的特异性结合，通过血液循环积聚到靶器官或靶组织，从而使其在超声显像中得到特异性增强或起到靶向治疗的作用。tUCAs与普通UCAs相比，前者能够从分子水平识别并结合病变部位，从而实现靶区增强显影。构成MB壳层的磷脂表面可进行多种修饰，使之能与不同分子结合，实现靶向显影。目前tUCAs还处于基础研究阶段，除了用于肿瘤、血栓、炎症、血管再生等临床常见且风险较高的疾病进行诊断外，其还可作为药物递送系统进行载药，在靶向显影的基础上进行治疗。RGD肽是一类含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽，广泛存在于人体内，是整合素与其配体蛋白作用的识别位点，此结构作为受体广泛存在于细胞外基质成份中，如纤维蛋白原、玻璃体结合蛋白、骨桥蛋白等，在血管再生、血栓、炎症、肿瘤等机体病理活动中发挥了重要作用，因此，该多肽及其衍生物成为肿瘤及血栓靶向治疗等疾病关注与研究的热点。在机体出血启动凝血反应的过程中，血小板发挥了重要作用。静止的血小板膜表面存在着许多糖蛋白(GP)，其中GPIIb/IIIa复合物，即αIIbβ3整合素，是血小板含量最多的糖蛋白，30％的GPIIb/IIIa复合物是以隐蔽状态分布于开放管道系统和α颗粒上。当血小板活化时，处于隐蔽状态的GPIIb/IIIa复合物全部表达在膜表面并发生空间构型的改变，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列是血小板GPIIb/IIIa受体特异性的识别、结合位点，纤维蛋白原便是通过该识别序列与血小板结合。包含RGD序列的多肽对于GPIIb/IIIa有很强的粘附性，其中环状RGD多肽[Cyclic(c)RGD，cRGD]较之于线性RGD多肽有更强的粘附性，前者是后者的30倍，在体内高速血流条件下Cyclic(c)RGD更具有粘附活化血小板的优势。与血栓形成相似，在创伤出血时，机体凝血瀑布样反应即刻启动，血小板受到损伤血管等因素的刺激后活化、聚集，成为血小板凝块，起到初期止血作用，活化血小板表面暴露的GpⅡb/Ⅲa可以特异性地与RGD肽结合。RGD多肽作为活化血小板GPIIb/IIIa受体的特异性识别序列，目前多用于动脉粥样硬化不稳定斑块显影及靶向治疗的基础研究中。目前临床上对于腹部实质脏器损伤的出血，尤其是活动性出血，基本可以诊断，但是对于渗血，CEUS仍无法观察。目前尚未见CEUS诊断渗血的文献报道及该方面研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种RGD靶向造影微泡及其制备方法。本专利技术的另一目的在于提供RGD靶向造影微泡结合CEUS技术在体内脏器渗血的靶向显影诊断中的应用。本专利技术提供的RGD靶向造影微泡，通过以下方法制备得到：包括以下步骤：(1)DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal加入到容器中，并加入CH2Cl2，待其完全溶解后进行干燥，至容器底部成一层脂质薄膜；(2)向步骤(1)中容器中加入PBS与甘油的混悬液，摇动使脂质薄膜均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；加入RGD溶液，过夜反应；(3)将步骤(2)中过夜反应的液体转移至有盖容器中，封口，向有盖容器里的空气置换为C3F8气体，机械震荡，得到乳白色混悬液；(4)将乳白色混悬液倒入干净容器中，加入PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBRGD，即RGD靶向造影微泡。本专利技术的DPPC为二棕榈酰磷脂酰胆碱的缩写，DSPE-PEG(2000)-Mal为二硬脂酰磷脂乙醇胺-聚乙二醇(2000)-马来酰亚胺。RGD为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。RAD为精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸。上述步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为4-6:1-3。优选地，步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为5:2。上述步骤步骤(1)的干燥温度为40-48℃。优选干燥温度为45℃。本专利技术的RGD靶向造影微泡，其制备方法的步骤(2)中PBS与甘油的混悬液中，PBS与甘油的体积比为9：1。进一步地，步骤(2)是按照RGD：Mal的摩尔比1:30加入RGD溶液的。本专利技术的RGD靶向造影微泡，其制备方法的步骤(4)中加入的PBS与乳白色混悬液的体积比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RGD靶向造影微泡，其特征在于，通过以下方法制备得到：包括以下步骤：(1)DPPC与DSPE‑PEG(2000)‑Mal加入到容器中，并加入CH2Cl2，待其完全溶解后进行干燥，至容器底部成一层脂质薄膜；(2)向步骤(1)中容器中加入PBS与甘油的混悬液，摇动使脂质薄膜均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；加入RGD溶液，过夜反应；(3)将步骤(2)中过夜反应的液体转移至有盖容器中，封口，向有盖容器里的空气置换为C3F8气体，机械震荡，得到乳白色混悬液；(4)将乳白色混悬液倒入干净容器中，加入PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBRGD，即RGD靶向造影微泡。

【技术特征摘要】
1.一种RGD靶向造影微泡，其特征在于，通过以下方法制备得到：包括以下步骤：(1)DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal加入到容器中，并加入CH2Cl2，待其完全溶解后进行干燥，至容器底部成一层脂质薄膜；(2)向步骤(1)中容器中加入PBS与甘油的混悬液，摇动使脂质薄膜均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；加入RGD溶液，过夜反应；(3)将步骤(2)中过夜反应的液体转移至有盖容器中，封口，向有盖容器里的空气置换为C3F8气体，机械震荡，得到乳白色混悬液；(4)将乳白色混悬液倒入干净容器中，加入PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBRGD，即RGD靶向造影微泡。2.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为4-6:1-3。3.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为5:2。4.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(1)的干燥温度为40-48℃。5.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(2)中PBS与甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎檀实，吕发勤，周璇，冯聪，陈力，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11