一种可溶且稳定的异质二聚TCR制造技术

本发明专利技术公开了一种在其α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键的异质二聚TCR，本发明专利技术的TCR可溶且稳定，能够被很好地复性、重折叠、纯化同时能够与其原配体特异性结合，而且本发明专利技术的T细胞受体具有较高的Tm值。本发明专利技术还公开了所述TCR的制备方法及用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体地说，本专利技术涉及一种可溶性T细胞受体及其制法、和应用。
技术介绍
仅仅有两种类型的分子能够以特异性的方式识别抗原。其中一种是免疫球蛋白或抗体；另一种是T细胞受体(TCR)，它是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”，即TCRα链可变域(Vα)和TCRα链恒定域(Cα)，TCRβ链可变域(Vβ)和TCRβ链恒定域(Cβ)。TCR是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，这种外源肽或内源肽可能会是细胞出现异常的唯一迹象。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因此，TCR对免疫系统的细胞免疫功能是至关重要的。如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样，TCR也可以被开发应用于诊断和治疗。可溶性TCR有很广泛的用途，它不仅可用于研究TCR-pMHC的相互作用，也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地，可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞，或者用来抑制T细胞(如那些与自身免疫性肽抗原进行反应的T细胞)。另外，可溶性TCR还可与其他分子(如，抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的细胞,起到杀伤作用。天然存在的TCR是一种膜蛋白，通过其跨膜区得以稳定，对于获得可溶性TCR蛋白而言，当TCR与膜分离开时，获得保持与其原配体(即pMHC)结合能力的可溶且稳定的TCR是一件非常困难的事情(Shin,etal.,(1993)science259:1901)。其不稳定性和蛋白产量低成为用TCR或其片段来开发治疗剂或诊断试剂的主要障碍。有些文献描述了截短形式的TCR，它仅仅包含胞外区或者仅仅包含胞外和胞质区，尽管这样的TCR可以被TCR特异性的抗体识别，但是产率很低，并且低浓度时不能识别主组织相容性复合体-肽复合物，说明其很容易变性，不够稳定。本领域技术人员致力于开发出可溶的、稳定性T细胞受体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可溶且稳定的异质二聚TCR及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种αβ异质二聚TCR，所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。在另一优选例中，所述TCR的人工链间二硫键位于α链可变区的FR2及β链的恒定区之间。在另一优选例中，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了位于TRAV的第46位或第47位氨基酸残基。在另一优选例中，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位或第61位氨基酸残基。在另一优选例中，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。在另一优选例中，所述TCR是可溶的。在另一优选例中，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。在另一优选例中，β链恒定域中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基被替换为另一氨基酸，优选地，被替换为丙氨酸或丝氨酸。在另一优选例中，在所述TCRβ链恒定域的C末端截短以去除形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。在另一优选例中，所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域。在另一优选例中，所述TCRα与β链恒定域之间不存在天然链间二硫键。在另一优选例中，在所述TCRα链和/或β链恒定区的C末端截短以去除形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。在另一优选例中，所述TCRα链和/或β链恒定区中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基被替换为另一残基。在另一优选例中，所述TCR的α链恒定区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。在另一优选例中，在TCRα链恒定区与β链恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：TRAC*01外显子1的48T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的57S；TRAC*01外显子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的77S；TRAC*01外显子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的17S；TRAC*01外显子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的59D；TRAC*01外显子1的15S和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的15E；TRAC*01外显子1的53R和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的54S；TRAC*01外显子1的89P和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的19A；或TRAC*01外显子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的20E。在另一优选例中，所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。在另一优选例中，与所述TCR结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或其组合。在另一优选例中，与所述TCR结合的治疗剂为连接于所述TCR的α或β链的C-或N-末端的抗-CD3抗体。在另一优选例中，所述TCR的Tm值≥45℃，优选地≥50℃，更优选地≥52℃，最优选的≥55℃。本专利技术的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本专利技术第一方面所述的TCR的α链和/或β链的核酸序列或其互补序列。本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第二方面所述的核酸分子。本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞或遗传改造的工程细胞，所述的细胞含有本专利技术第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本专利技术第二方面所述的核酸分子。本专利技术的第五方面，提供了一种分离的细胞，其表达本专利技术第一方面所述的TCR。本专利技术的第六方面，提供了一种制备本专利技术第一方面所述的T细胞受体的方法，包括步骤：(i)培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞，从而表达本专利技术第一方面所述的T细胞受体的α链和/或β链；(ii)分离或纯化出所述的α链和/或β链；(iii)重折叠所述的α链和/或β链，获得所述T细胞受体。本专利技术的第七方面，提供了一种T细胞受体复合物，所述的复合物含有一个或多个本专利技术第一方面所述的TCR。本专利技术的第八方面，提供了本专利技术第一方面所述的TCR的用途，用于制备治疗肿瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种αβ异质二聚TCR，其特征在于，所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键；优选地，所述TCR的人工链间二硫键位于α链可变区的FR2及β链的恒定区之间；更优选地，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了位于TRAV的第46位或第47位氨基酸残基；和/或形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位或第61位氨基酸残基；最优选地，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种αβ异质二聚TCR，其特征在于，所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键；优选地，所述TCR的人工链间二硫键位于α链可变区的FR2及β链的恒定区之间；更优选地，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了位于TRAV的第46位或第47位氨基酸残基；和/或形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位或第61位氨基酸残基；最优选地，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR是可溶的。优选地，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。3.一种核酸分子，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李懿，
申请(专利权)人：广州市香雪制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44