TCR文库制造技术

本发明专利技术涉及颗粒文库，所述文库展示多种不同T细胞受体(TCR)，其中多种TCR基本由包含来自天然库的α链可变结构域和来自天然库的β链可变结构域的TCR组成，其中α链可变结构域包含TRAV12‑2或TRAV21基因产物，并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术实现思路
本专利技术涉及颗粒文库，所述文库展示多种不同T细胞受体(TCR)，其中多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中α链可变结构域包含TRAV12-2或TRAV21基因产物，并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物。背景T细胞受体(TCR)介导T细胞识别特异性主要组织相容性复合物(MHC)-限制型的肽抗原并且对于免疫系统的细胞臂的功能而言是必要的。TCR仅以膜结合的形式存在，并且因此，TCR在历史上非常难以分离。大多数TCR由2条二硫键连接的多肽链，α链和β链组成。本文使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名描述TCR并且连接到TCR序列的IMGT公共数据库。天然α-β异二聚体TCR具有α链和β链。广泛地，各链包含可变、连接和恒定区，并且β链通常含有可变区和连接区之间的短多变区，但是该多变区通常被认为是连接区的部分。各可变区包含包埋在框架序列中的3个高变CDR(互补决定区)；CDR3被认为是抗原识别的主要介导物。存在几种类型的α链可变区(Vα)和几种类型的β链可变区(Vβ)，它们通过它们的构架、CDR1和CDR2序列，以及通过部分限定的CDR3序列区分。Vα型在IMGT命名中由独特的TRAV数指代。因此，“TRAV21”定义具有独特构架和CDR1以及CDR2序列和CDR3序列的TCR Vα，该CDR3部分被氨基酸序列限定，该氨基酸序列在TCR之间保守，但是其也包含TCR之间变化的氨基酸序列。以相同的方式，“TRBV6-5”定义了具有独特的构架与CDR1和CDR2序列，但是仅仅有部分定义的CDR3序列的TCR Vβ区。出于本申请的目的，我们使用在α和β基因座内分别有54种功能性α可变基因和67种功能性β可变基因的一般假设。然而，由于功能限定或重复，这一数字可随着研究过程变化并且可能认为α和β可变基因的数量与现在的不同。因此，为了清楚起见，我们一致指在IMGT网站www.imgt.org(2013年3月10日获得)上发现的国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名。类似地，TCR的连接区由独特IMGT TRAJ和TRBJ命名所定义，并且恒定区由IMGT TRAC和TRBC命名所定义。β链多变区在IMGT命名中以缩写TRBD提及并且如上所述，级联的TRBD/TRBJ区通常一起被认为是连接区。编码TCRα和β链的基因集合位于不同的染色体上并且含有分离的V、(D)、J和C基因区段，其通过在T细胞发育期间重排而汇聚在一起。由于在54个TCRα可变基因和61个αJ基因之间或者67个β可变基因、2个βD基因和13个βJ基因之间出现的大量潜在重组事件，这导致T细胞α和β链非常高的多样性。重组过程并不精确并且在CDR3区内引入另外的多样性。各α和β可变区也可含有等位基因变体，在IMGT命名中分别称为TRAVxx*01和*02，或TRBVx-x*01和*02，因此进一步增加的变化形式的量。通过相同的方式，TRBJ序列中的一些具有2种已知变化形式。(请注意没有限定符“*”表示相关序列仅已知一种等位基因)。已经估计通过重组和胸腺选择产生的人TCR的天然库包含由CDR3多样性所确定(Arstila,T.P.等，(1999)Science,286(5441),958-61)的大约106种独特β链序列，并且甚至可能更高(Robins,H.S.等，(2009)Blood,114(9),4099-4107)。估计各β链与至少25种不同的α链配对，因此生成另外的多态性(Arstila,T.P.等，(1999)Science,286(5441),958-61)。在本申请的说明书和权利要求中，术语“TCRα可变结构域”因此是指TRAV和TRAJ区的级联，仅TRAV区，或仅TRAV和部分TRAJ区，并且术语TCRα恒定结构域是指胞外TRAC区或者是指C-末端截短的TRAC序列。类似地，术语“TCRβ可变结构域”可指TRBV和TRBD/TRBJ区的级联，仅TRBV和TRBD区，仅TRBV和TRBJ区，或仅TRBV和部分TRBD和/或TRBJ区，并且术语TCRβ恒定结构域是指胞外TRBC区或者是指C-末端截短的TRBC序列。由IMGT命名定义的独特序列是TCR领域工作人员广泛熟知并可得的。例如，可在IMGT公共数据库中检索到它们。《T细胞受体资料手册》(T cell Receptor Factsbook)，(2001)LeFranc和LeFranc，学术出版社(Academic Press)，ISBN 0-12-441352-8也公开了由IMGT命名定义的序列，但是由于其出版日期和随后的时间延迟，其中的信息有时需要通过参考IMGT数据库来确认。长期需要鉴定基本由特异性结合至特定抗原的天然α和β链序列组成的TCR，使得能够开发出例如该TCR或其可溶性类似物以提供潜在治疗的基础。由鉴定的TCR识别的抗原可与疾病，如癌症、病毒感染、自身免疫疾病、寄生虫感染和细菌感染相关。因此，这类疗法可用于治疗所述疾病。此外，一旦已经鉴定到天然或自然TCR并确定其序列，可根据需要引入导致亲和性或半衰期增加的突变，如WO2012/013913中所述的那样。传统上，鉴定特异性结合至疾病相关抗原，如癌症、病毒、自身免疫或细菌抗原的TCR的尝试局限于使用从志愿者供体获取的血液样品。可使用这类样品来分离T细胞及其结合疾病相关抗原的相应TCR。这种方法一般需要至少20个供体。过程漫长且费力，并且无法保证鉴定到抗原结合T细胞受体。在鉴定到功能性T细胞受体的情况中，它们通常在体外对抗原有弱亲和性，低特异性，和/或不恰当折叠。能够分泌的T细胞的多样性局限于供体内的T细胞多样性。一些疾病相关抗原，包括大多数的癌症抗原是自身抗原；因为胸腺选择去除了识别自身抗原的TCR，针对疾病相关抗原有特异性的TCR可能在供体的天然库中不存在，或者可能对抗原有弱亲和性。设计新的文库来分离具有抗原结合特异性的新TCR的尝试已经持续多年。产生TCR文库远远难于相当的抗体文库，因为TCR链较不稳定并且通常不正确展示。构建TCR文库所涉及的复杂性是巨大的。优选在CDR3长度上保留变化(如天然库中发现的那样)。任何文库的大量部分一般由于终止密码子、移码、折叠问题和仅仅不能结合HLA复合物的TCR链组合而丢失。考虑到大量的可变α和可变β基因，以及J和D基因，产生并鉴定一起形成以需要的特异性结合至抗原肽的TCR的功能性折叠的α链和功能性折叠的β的几率是极低的。在构建文库上已经进行了多种尝试。本文下文中首先描述的是基于合成TCR文库；即，文库中的TCR含有突变，一般在CDR内，其已经在体外使用随机突变导入。因此，在这些文库中含有的任意单独TCR链的序列可能不对应于天然库中发现的任意。由于在合成文库中仅存在某些突变，整个文库将不对应于天然库。在之前公开的合成文库中，向单个已知TCR的α和β链的CDR区中导入随机突变，使得文库中的所有TCR都含有相同的α和β框架序列，但有随机生成的CDR序列。对文库的进一步分析证明，鉴定抗原特异性TCR是不成功的。具体地，由于多种原因，发现很大比例的TCR链是非功能性的：在许多情况中，序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种颗粒文库，所述文库展示多种不同T细胞受体(TCR)，其中所述多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中所述α链可变结构域包含TRAV12‑2和/或TRAV21基因产物，并且所述β链可变结构域包含TRBV6基因产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.14 GB 1404536.3;2014.12.02 GB 1421336.7;201.一种颗粒文库，所述文库展示多种不同T细胞受体(TCR)，其中所述多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中所述α链可变结构域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因产物，并且所述β链可变结构域包含TRBV6基因产物。2.一种颗粒文库，所述文库展示多种不同TCR，其中多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中所述α链可变结构域包含TRAV12-2或TRAV21基因产物，并且所述β链可变结构域包含TRBV6基因产物，并且其中至少一部分的TCR包含具有非天然突变的β链可变结构域和/或α链可变结构域。3.如权利要求1或权利要求2所述的文库，其特征在于，所述TRBV6基因产物是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因产物。4.如权利要求1-3中任一项所述的文库，其特征在于，所述TCRα链可变结构域包含TRAV12-2基因产物。5.如权利要求1-3中任一项所述的文库，其特征在于，所述TCRα链可变结构域包含TRAV21基因产物。6.如权利要求1-5中任一项所述的文库，其特征在于，所述α链可变结构域和所述β链可变结构域以单个多肽链展示。7.如权利要求1-5中任一项所述的文库，其特征在于，所述TCR在α链的恒定区与β链的恒定区之间包含非天然二硫键。8.如权利要求1-5中任一项所述的文库，其特征在于，所述TCR在α链的恒定区与β链的恒定区之间包含天然二硫键。9.如权利要求1-5中任一项所述的文库，其特征在于，各α链和各β链包含二聚化结构域。10.如权利要求9所述的文库，其特征在于，所述二聚化结构域是异源的。11.如权利要求1-10中任一项所述的文库，其特征在于，所述颗粒是噬菌体颗粒。12.如权利要求1-10中任一项所述的文库，其特征在于，所述颗粒是核糖体。13.如权利要求1-10中任一项所述的文库，其特征在于，所述颗粒是酵母细胞。14.如权利要求1-10中任一项所述的文库，其特征在于，所述颗粒是哺乳动物细胞。15.一种从权利要求1-14中任一项所述的文库获得的包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域的非天然的分离T细胞受体(TCR)，所述TCRα链可变结构域含有TRAV12-2基因产物或TRAV21基因产物，所述TCRβ链可变结构域含有TRBV6基因产物。16.如权利要求15所述的TCR，其特征在于，所述TRBV6基因产物是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·K·雅各布森，P·E·莫洛伊，A·B·维德波，N·R·利迪，
申请(专利权)人：英美偌科有限公司，艾达普特免疫有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB