具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法至少包括：1）准备3‑10种候选的固氮蓝藻藻株、至少2种土壤中的细菌以及为微孔细胞培养板，设计藻‑藻共生实验以及藻‑菌共生实验将藻株和细菌接种在微孔细胞培养基上培养以评价不同固氮蓝藻以及固氮蓝藻和细菌之间的相互作用；2）测定每组实验中的固氮蓝藻的叶绿素a以及细菌的CFU个数。采用本发明专利技术中的实验方案能够有效的筛选出符合生产应用的具有生物肥效力的固氮蓝藻。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种筛选方法，具体的为一种具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，属于微生物领域。
技术介绍
蓝藻，又称蓝绿藻、蓝细菌，是藻类生物中最简单、最原始的一种微藻。固氮蓝藻如念珠藻(Nostoc)、鱼腥藻(Anabaena)、单崎藻(Tolypothrix)等，均能够通过细胞中固氮酶的作用，将大气中游离态的分子氮还原成可供植物利用的氮素化合物，同时在其生长过程中不断分泌出多糖、氨基酸、多肽等氮类化合物及活性物质，在提高土壤肥力的同时促进作物生长。Karthikeyan等研究了从小麦根际分离得到的三种蓝藻(Calothrixghosei、Hapalosiphonintricatus、Nostocsp.)对谷物产量的影响，结果表明，不同环境、不同蓝藻组合对谷物产量的影响不同，Hapalosiphonintricatus及三种蓝藻组合的使用使得谷物产量明显增加，Hapalosiphonintricatus及Nostocsp.的组合的使用使得谷物的高度明显增高。Prasanna等通过研究宽松鱼腥藻(Anabaenalaxa)、鱼腥藻(Anabaenasp.)、人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)对大米产量的影响，结果发现，三种微生物同时作用时，大米的产量较未加任何微生物的大米的产量提高了19.02％，每公顷节约N为40-80Kg。Kumar等研究了不同蓝藻及不同嗜热细菌组合对香料作物生长的影响，结果发现，添加只添加鱼腥藻的实验组的茴香种子发芽率较未添加微生物的实验组的茴香种子发芽率增加了25％，只添加了眉蓝细菌实验组的芽/根长度较未加任何微生物的实验组的芽/根长度增加了30％-50％。董俊德等在北京水稻田分离出固氮蓝藻6属15种。按每公顷接种1125kg鲜混合藻，该混合藻由念珠藻(BA02和BA03)、鱼腥藻(BA01)及少量筒孢藻(BA66)。分蘖期主要是固氮蓝藻和固氮菌共同固氮，抽穗期主要是蓝藻固氮。王秀红等在上海地区的水稻田施用鲜藻750kg/公顷，干藻80kg/公顷。藻种也是武汉水生生物研究所来的混合藻种。肥效和有机肥及化肥相当。齐永安等用武汉水生生物研究所在湖北大面积应用的8种单藻组成的混合藻，以及由南京和武汉引来的9个单藻组成的混合藻种在黑龙江尚志县做了水稻大田实验，增产效果明显。这些实验充分验证了固氮蓝藻作为微生物肥料对水稻的增产效果。一般来说，筛选具有生物肥料潜力的蓝藻，先在实验室内对微藻的生长和固氮酶活性进行评价，再做花盆实验考察对微藻作物的萌发或增产效果，有些还需要在大田培养考察生长情况。但是实验室筛选存在的问题有以下几个方面1)实验室内的生长评价一般是仅对单一藻种进行，而在实际应用中往往使用的是混合藻种；2)实验室内的固氮酶活性测定一般是在缺氮或限氮条件下进行的，实际应用时土壤中不会处于严格缺氮的状态，而且固氮酶活性在固氮蓝藻的生命周期中也是变化的，实验室内的考察指标仅具有参考价值；3)蓝藻对作物的增产机制也不仅限于固氮带来的土壤有效氮含量增加。此外，土壤的微生物种群非常丰富，即使接种了大量的固氮蓝藻，经过土壤微生物种群的动态调整，蓝藻在其中还是处于丰度较低的种群。由于多种固氮蓝藻之间可能存在相互抑制作用，蓝藻和土壤微生物间也存在相互作用，因此高效率的筛选多种固氮蓝藻组合是很有必要的。高通量筛选是指以分子水平和细胞水平的试验方法为基础，以微板形式作为实验工具的实验过程，简言之是指通过一次实验可以获得大量信息，并从中找到有价值的信息。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种高效的具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供了一种具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法至少包括：1)准备3-10种候选的固氮蓝藻藻株、至少2种土壤中的细菌以及为微孔细胞培养板，设计藻-藻共生实验以及藻-菌共生实验将藻株和细菌接种在微孔细胞培养基上培养以评价不同固氮蓝藻以及固氮蓝藻和细菌之间的相互作用；2)测定每组实验中的固氮蓝藻的叶绿素a以及细菌的CFU个数。3)选出叶绿素a增加2mg/L以上以及细菌CFU个数超过2×106/L。优选地,所述步骤1)中每个实验方案中固氮蓝藻的初始细胞接种密度为0.01-0.2g/L。优选地,所述固氮蓝藻含有两种或者三种固氮蓝藻且每种固氮蓝藻的干重相同。优选地,所述步骤1)中的细菌选自现有微生物菌种库或野外筛选到的土壤微生物，包括芽孢杆菌和解磷菌。优选地,所述步骤1)中每种细菌的初始CFU为1×105-2×106L-1。优选地,所述步骤1)中的微孔细胞培养板的孔体积为3-5mL，培养基为BG11培养基，培养的温度为20-30℃，光照强度为70-120μmol/m2/s，光暗循环(光：暗＝14:10)，培养时间为6-8天。优选地，所述步骤1)中的设计藻-藻共生实验以及藻-菌共生实验是根据高通量原理获得的实验方案。优选地,还包括步骤3)设计盆栽实验验证固氮蓝藻对土壤肥力的影响。优选地,所述步骤3)中盆栽实验培养温度20-30℃，光强度为50-150mol/m2/s，光暗循环(光：暗＝14:10)。优选地,所述固氮蓝藻对土壤肥力的影响的判断指标为测定在土壤中加入固氮蓝藻的第10-15天测定土壤中有效磷、可溶性有机碳及总可溶性氮含量的变化量。如上所述，本专利技术的蓝藻多糖的制备和使用方法，具有以下有益效果：采用本实验筛选出的固氮蓝藻可以从整体上反应出对土壤微生物的影响,并不局限于仅仅根据固氮的能力作为判断指标,所以评价结果更加符合实际应用；本实验筛选出的实验可以筛选出当具有多种藻共生时具有高效生物肥效力藻株，相对于在单一藻株存在的条件下的筛选结构更加符合现实需求。附图说明图1实施例1中固氮蓝藻与Btsk共培养7天后后叶绿素a含量的增加；图2实施例1中固氮蓝藻与Pf共培养7天后后叶绿素a含量的增加；图3实施例1中固氮蓝藻与细菌混合物共培养7天后后叶绿素a含量的增加；图4a实施例1固氮蓝藻与细菌Btsk共培养7天后菌的CFU数量；图4b实施例1固氮蓝藻与细菌Pf共培养7天后菌的CFU数量；图4c实施例1固氮蓝藻与混合细菌共培养7天后菌的CFU数量；图5A为实施例2中固氮蓝藻对土壤中有效磷的影响；图5B为实施例2中固氮蓝藻对土壤中可溶性有机碳的影响；图5C为实施例2中固氮蓝藻对土壤中总可溶性氮的影响。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法至少包括：1)准备候选的固氮蓝藻藻株、至少2种土壤中的细菌以及微孔细胞培养板，设计包括各种排列的藻‑藻共生实验以及藻‑菌共生实验将藻株和细菌接种在微孔细胞培养基上培养以评价不同固氮蓝藻以及固氮蓝藻和细菌之间的相互作用；2)测定每组实验中的固氮蓝藻的叶绿素a以及细菌的CFU个数；3)选出叶绿素a增加2mg/L以上以及细菌CFU个数超过2×106/L。

【技术特征摘要】
1.一种具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法至少包括：1)准备候选的固氮蓝藻藻株、至少2种土壤中的细菌以及微孔细胞培养板，设计包括各种排列的藻-藻共生实验以及藻-菌共生实验将藻株和细菌接种在微孔细胞培养基上培养以评价不同固氮蓝藻以及固氮蓝藻和细菌之间的相互作用；2)测定每组实验中的固氮蓝藻的叶绿素a以及细菌的CFU个数；3)选出叶绿素a增加2mg/L以上以及细菌CFU个数超过2×106/L。2.根据权利要求1所述的具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于：所述步骤1)中每个实验方案中固氮蓝藻的初始细胞接种密度为0.01-0.2g/L。3.根据权利要求2所述的具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于：所述固氮蓝藻含有两种或者三种固氮蓝藻且每种固氮蓝藻的干重相同。4.根据权利要求1所述的具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于：所述步骤1)中的细菌选自现有微生物菌种库或野外筛选到的土壤微生物，包括芽孢杆菌和解磷菌。5.根据权利要求1具有生物肥应用潜力的固氮蓝藻的筛选方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙予罕，薛垂召，赵权宇，王丽波，汪靓，唐涛，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31