一种绿茶丙烯酰胺测定方法与应用技术

本发明专利技术涉及分析检测技术领域，为解决目前测定食品中丙烯酰胺含量因不同食品基质影响方法的检测效果问题，本发明专利技术提出了一种绿茶丙烯酰胺测定方法与应用，以13C3‑丙烯酰胺为内标，采用多选择反应监测模式，通过方法学论证，构建基于HPLC‑MS/MS的绿茶丙烯酰胺定量分析方法，本发明专利技术的检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中丙烯酰胺的实际检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析检测
，具体地说涉及一种绿茶丙烯酰胺测定方法与应用。
技术介绍
丙烯酰胺(Acrylamide)，化学分子式CH2CHCONH2，是一种易溶水的无色透明片状结晶，作为一种常见的有机合成原料，在工业上得到了广泛的应用。国际癌症研究中心(IRAC)将丙烯酰胺列为IIA类致癌物；WHO认为“致癌风险性超过10-5的指导值为0.5ug/L”；自2002年瑞典科学家首次发现淀粉类食品在高温加工过程中会产生大量的丙烯酰胺后即引起全球广泛关注。我国是世界茶叶大国，茶园面积、茶叶产量位居世界第一。茶叶内质成分丰富，加工工序多样，茶种类多，有研究表明，制茶过程中茶叶内质成分会发生复杂的化学变化，从而产生丙烯酰胺等潜在危害物，茶叶加工过程安全已成为食品安全领域关注的新焦点。目前，国际上多采用HPLC-MS/MS方法测定食品中丙烯酰胺含量，该方法操作简单、灵敏度较高，但不同食品基质会影响方法的检测效果。
技术实现思路
为解决目前测定食品中丙烯酰胺含量因不同食品基质影响方法的检测效果问题，本专利技术提出了一种绿茶丙烯酰胺测定方法与应用，检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中丙烯酰胺的实际检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种绿茶丙烯酰胺测定方法为：(1)样品前处理：称取粉碎后的绿茶样品依次加入甲酸、同位素标记丙烯酰胺标准溶液，混匀，在30-90℃水浴并振荡10-60min；然后依次加入乙腈、硫酸镁、氯化钠，密封振荡，离心；取上清液，水浴下氮气吹干，过滤，得到预处理样品；所述的同位素标记丙烯酰胺标准溶液为13C3-丙烯酰胺溶解于体积百分比浓度0.1％甲酸中制得，13C3-丙烯酰胺的浓度为30-70ng/mL。绿茶粉末、甲酸、同位素标记丙烯酰胺标准溶液的质量体积比为1g∶7-11mL∶0.8-1.2mL。绿茶粉末、乙腈、硫酸镁、氯化钠的质量体积比为1g∶9-11mL∶3-5g∶0.5-1.5g。作为优选，通过5000-12000rpm/min离心4-10min，取上清液，在30-90℃水浴下氮气吹干，经0.45μm微孔滤膜过滤。(2)净化：采用固相萃取柱对预处理样品进行净化处理，得到待测样品；所述的净化方法为：对固相萃取柱进行预处理后，将步骤(1)得到的预处理样品进行上样，收集透过液，过膜，得到待测样品。(3)采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行检测，通过内标法计算丙烯酰胺含量。分别将试样和系列标准品注入HPLC-MS/MS系统，记录丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺峰面积，以丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标作图，绘制丙烯酰胺标准曲线。由此计算样品中丙烯酰胺的含量。作为优选，每个处理进行三次重复，取其平均值进行分析。色谱测试条件为：流动相包括体积浓度为为99.9％的水、乙腈的混合液与流动相体积浓度为0.1％的甲酸；流速为200μL/min；进样体积10μL；柱温34-36℃，其中水、乙腈的混合液中水与乙腈的体积比为99∶1。质谱条件：离子化方式为ESI离子源；扫描方式为正电离；检测方式为多离子反应监测，碰撞能量为8eV，碰撞诱导解离电压：50V。离子源条件：干燥气温度：325C；干燥气流速：5L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3000V，其中：本专利技术针对绿茶基质特性，优化样品前处理方法，以13C3-丙烯酰胺为内标，采用多选择反应监测(MRM)模式，通过方法学论证，构建基于HPLC-MS/MS的绿茶丙烯酰胺定量分析方法，同时根据该分析方法在茶区茶样分析方法上进行了应用，对我国主要产茶区的10个绿茶样品进行了丙烯酰胺测定。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中丙烯酰胺的实际检测。附图说明图1为实施例丙烯酰胺标准曲线图；图2为实施例混标中13C3-丙烯酰胺、丙烯酰胺的MRM质谱图；图3为实施例绿茶样品13C3-丙烯酰胺、丙烯酰胺的MRM质谱图。具体实施方法下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或用常规方法制备。实施例中丙烯酰胺标准品，纯度＞95％，(ChemService公司，美国)；13C3-丙烯酰胺标准品，纯度＞99％，(ChemService公司，美国)；甲醇、乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、正己烷、硫酸镁(MgSO4)、氯化钠(NaCl)均购自国药集团化学试剂有限公司。准确称取0.1g丙烯酰胺标准品溶于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，于-20℃冰箱保存作为储备溶液，配制浓度为1、5、10、50和100ng/mL的丙烯酰胺标准溶液，13C3-丙烯酰胺为内标，浓度为50ng/mL。实施例中Agilent 6460 Triple Quad LC-MS三重串联四极杆液质联用仪，Agilent Zorbax SB C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；SPE固相萃取柱Cleanert PCX(60mg，天津博纳艾杰尔有限公司)，利用Mass hunter液质工作站软件(Agilent公司，美国)采集相关数据。实施例1(1)称取1g粉碎后的绿茶样品于50mL离心管中，依次加入9mL体积浓度为0.1％甲酸、1mL50ng/mL内标液(13C3-丙烯酰胺溶解于0.1％甲酸中)，混匀，于30℃下水浴振荡20min；然后加入10mL乙腈、4g硫酸镁、1g氯化钠，密封迅速剧烈振荡1min，于5000r/min离心10min，取上清液8ml，在40℃水浴下氮气吹干；取1ml超纯水溶解试管壁上的残余物，经0.45μm的微孔滤膜过滤。(2)将步骤(1)得到的预处理样品进行上样，对固相萃取柱进行预处理后，收集透过液，经0.22μm膜过滤，待测。(3)通过HPLC-MS/MS分析检测色谱条件：流动相为水-乙腈(99∶1，V/V)混合液，体积浓度为99，9％，体积浓度为0.1％的甲酸；流速为200μL/min；进样体积10μL；柱温35C。质谱条件：离子化方式：ESI离子源；扫描方式：正电离；扫描离子对：丙烯酰胺(m/z 72-55)，13C3-丙烯酰胺(m/z 75.2-58.1)。检测方式：多离子反应监测(MRM)，碰撞能量：8eV，碰撞诱导解离电压：50V。离子源条件：干燥气温度：325C；干燥气流速：5L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3000V。分别将试样和系列标准品注入HPLC-MS/MS系统，记录丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺峰面积，以丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标作图，绘制丙烯酰胺标准曲线。由此计算样品中丙烯酰胺的含量。每个处理进行三次重复，取其平均值进行分析，数据用表示。实施例2(1)称取1g粉碎后的绿茶样品于50mL离心管中，依次加入7mL体积浓度为0.1％甲酸、0.8mL30ng/mL内标液(13C3-丙烯酰胺溶解于0.1％甲酸中)，混匀，于90℃下水浴振荡10min；然后加入9mL乙腈、5g硫酸镁、0.5g氯化钠，密封迅速剧烈振荡1min，于7000r/min离心7min，取上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绿茶丙烯酰胺测定方法，其特征在于，所述的测定方法为：(1)样品前处理：称取粉碎后的绿茶样品依次加入甲酸、同位素标记丙烯酰胺标准溶液，混匀，在30‑90℃水浴并振荡10‑60min；然后依次加入乙腈、硫酸镁、氯化钠，密封振荡，离心；取上清液，水浴下氮气吹干，过滤，得到预处理样品；(2)净化：采用固相萃取柱对预处理样品进行净化处理，得到待测样品；(3)采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行检测，通过内标法计算丙烯酰胺含量。

【技术特征摘要】
1.一种绿茶丙烯酰胺测定方法，其特征在于，所述的测定方法为：(1)样品前处理：称取粉碎后的绿茶样品依次加入甲酸、同位素标记丙烯酰胺标准溶液，混匀，在30-90℃水浴并振荡10-60min；然后依次加入乙腈、硫酸镁、氯化钠，密封振荡，离心；取上清液，水浴下氮气吹干，过滤，得到预处理样品；(2)净化：采用固相萃取柱对预处理样品进行净化处理，得到待测样品；(3)采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行检测，通过内标法计算丙烯酰胺含量。2.根据权利要求1所述的一种绿茶丙烯酰胺测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的同位素标记丙烯酰胺标准溶液为13C3-丙烯酰胺溶解于体积百分比浓度0.1％甲酸中制得，13C3-丙烯酰胺的浓度为30-70ng/mL。3.根据权利要求1或2所述的一种绿茶丙烯酰胺测定方法，其特征在于：步骤(1)绿茶粉末、甲酸、同位素标记丙烯酰胺标准溶液的质量体积比为1g∶7-11mL∶0.8-1.2mL。4.根据权利要求1所述的一种绿茶丙烯酰胺测定方法，其特征在于：步骤(1)绿茶粉末、乙腈、硫酸镁、氯化钠的质量体积比为1g∶9-11mL∶3-5g∶0.5-1.5g。5.根据权利要求1所述的一种绿茶丙烯酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：王彬，刘婧，刘青茹，田野，周春江，蒋玉兰，曾丽珍，唐靖，邸胜达，
申请(专利权)人：中华全国供销合作总社杭州茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33