一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法技术

本发明专利技术公开了一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法，所述检测应用方法包括如下步骤：S1.标准样品光谱集的建立：采用微型便携式近红外光谱仪于田间直接探测读取感染柑桔黄龙病病菌和不带黄龙病病菌柑桔植株叶片的近红外光谱学数据；S2.定性分类判别模型的建立：将S1中的近红外光谱学数据进行校正和预处理后，分别提取其近红外光谱学的特征值，经训练集训练和验证集验证后得到最优的PLS‑DA定性分类判别模型；S3.未知样品的定性判别：用S2建立的最优的PLS‑DA定性分类判别模型于田间直接区分待测柑桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病，单一植株仅需现场扫描3～5个叶片，耗时仅需1～2 min，便可实现快速实时确诊。本发明专利技术方法可进行柑桔黄龙病的田间快速诊断，操作简便，快速准确，对样本不产生任何损伤，并对环境友好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及果树病害田间的快速诊断
，具体地，涉及一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法。
技术介绍
柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)，是柑桔上的一种毁灭性病害，自20世纪初柑桔黄龙病在我国华南地区被首次报道以来，该病害已成为制约世界柑桔产业健康发展的最重要因素之一。柑桔植株一旦感染柑桔黄龙病，轻者影响柑橘的产量和品质，重者则造成柑桔植株的直接死亡，堪称柑桔产业上的“癌症”(Bove,2006；2015)。黄龙病病树的正确诊断和鉴定是生产上正确防治柑桔黄龙病的前提，因此掌握快速而有效的柑桔黄龙病诊断与检测技术，对及时发现柑桔黄龙病并采取相应的措施积极防治柑桔黄龙病具有重要实践意义。PCR检测技术是目前最有效的诊断技术，但是其仅限于在具备有一定设备条件的实验室内进行，而且需要熟练的技术人员，检测成本高昂，不适合进行田间大规模的排查(张利平，2009)。目前已有的田间直接诊断方法有：田间症状诊断法(张名福等，1998；田亚南等，1999)，碘染色法(张利平等，2009)，环介导等温扩增(LAMP)法(黄丽等，2012)，近红外光谱法等(刘燕德等2016)。田间症状诊断虽然快速简便，但是黄龙病的田间症状复杂多变，不同的生长季节在叶片、果实和植株上表现不同，且其症状易与柑桔衰退病、缺素症、天牛为害和除草剂药害相互混淆，给病害的准确诊断鉴定造成困难(Bove,2006)；碘染色法则特异性较差，准确度低，同样不适合进行柑桔黄龙病的田间早期诊断(张利平等，2009)；环介导等温扩增(LAMP)法的原理基本与PCR检测方法相同，需要先进行复杂的前处理，并需要熟练的技术人员(孔德英等，2013)；而现有报道的近红外光谱法是将柑桔叶片样本采集回到实验室内，再利用大型的傅里叶光谱仪进行分析，对不同类型柑桔叶片的光谱特征解释有较大意义，并从理论上明确了近红外光谱应用于柑桔黄龙病的诊断是可行的(刘燕德等，2016)；但现有报道并没有涉及该方法的田间应用技术，特别是没有涉及光谱数据的田间采集方法，难以适应于柑桔黄龙病的田间大规模快速诊断。因此，生产上依然急需一种简单易行，果农可以快速掌握，适合于田间大规模应用的柑桔黄龙病快速诊断技术。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法，具体包括以下步骤：S1.标准样品光谱集的建立：采用微型便携式近红外光谱仪于田间直接探测读取感染柑桔黄龙病病菌和不带黄龙病病菌柑桔植株叶片的近红外光谱学数据；S2.定性分类判别模型的建立：将S1中的近红外光谱学数据进行校正和预处理后，分别提取其近红外光谱学的特征值，经训练集训练和验证集验证后得到最优的PLS-DA定性分类判别模型；S3.未知样品的定性判别：用S2建立的最优的PLS-DA定性分类判别模型于田间直接区分待测柑桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病。本专利技术的方案，针对单一植株仅需现场扫描3～5个叶片，耗时仅需1～2min，便可实现快速实时确诊。作为优选实施方式，微型便携式近红外光谱仪探测读数的部位为叶片背面的主叶脉，叶龄为当年生或上年生的秋稍成熟叶片。为了让该模型很好的将感染柑桔黄龙病柑桔叶片样本与不带菌柑桔叶片样本进行正确归类。PLS-DA模型评价参数包括：决定系数(R2)、预测误差均方根(RMSEP)和交互验证均方根(RMSECV)。建立PLS-DA定性分类判别模型的评价标准为：(1)决定系数R2值越接近于1，表示所建立模型的预测值与真实值之间的相关性越好；(2)预测误差均方根(RMSEP)值越小，则能够表明试验结果和真实值越接近，并说明所建模型的预测精度越高；(3)交互验证均方根(RMSECV)作为主成分选择的主要依据，一般选在RMSECV值最低处对应的主成分数作为最佳主成分数；(4)RMSEP和SEP值越接近且越小代表模型性能越佳，预测精度越高。优选地，步骤S1所述的微型便携式近红外光谱仪采用的图谱采集软件为MicroNIR1.5.7，测量时间(典型值)为0.5s，测量波长范围为950～1650nm，采集背景为钢板，光源采集直径为16mm。优选地，步骤S2并利用移动窗口拟和多项式平滑法(Savitzky-Golay，SG)消除噪声
对光谱信号的影响，同时进行一阶求导以消除基线漂移和背景影响，采用随机样本划分法(RS)划分出为训练集和验证集。优选的，所述训练集和验证集中的柑桔叶片光谱学数据样本均从标准样品光谱集中选取。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术以田间采集的柑桔叶片近红外光谱学数据为基础，建立能对柑桔黄龙病进行定性分类判别的判别模型，建立一种柑桔黄龙病的近红外光谱学快速无损检测方法，以实现柑桔黄龙病的田间早期、准确以及快速无损诊断。相比目前常用的PCR检测技术，本专利技术不需要在具备有一定设备条件的实验室内进行，可以直接在田间进行，每个样本的相对检测成本低廉，而且还可以极大缩短生产上柑桔黄龙病的检测周期，单一植株仅需现场扫描3～5个叶片，耗时仅需1～2min，便可实现快速实时确诊，有利于进行柑桔黄龙病的田间大规模排查。另外，本专利技术采用物理光谱学实现柑桔黄龙病的田间快速诊断，还可以对样本不产生任何损伤，并对环境友好。附图说明图1为不同柑桔叶片样本的MicroNIR原始光谱。图2为最优PLS-DA模型的预测结果。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1本实施例采用MicroNIR微型便携式近红外光谱仪直接于田间直接探测读取待测砂糖桔叶片的光谱学数据，并同时应用偏最小二乘判别(PLS-DA)模型进行定性分类判别，以区分待测砂糖桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病。1、砂糖桔叶片标准样品光谱集的建立：不带菌砂糖桔叶片样本与感染柑桔黄龙病砂糖桔叶片样本的近红外光谱学数据均通过微型近红外光谱仪(MicroNIR 1700Spectrometer)进行采集，图谱采集软件为MicroNIR 1.5.7，测量时间(典型值)为0.5s，
测量波长范围为950～1650nm，将吸收率低、折射率和反射率相对较好的钢板作为采集背景。每个样本取3点进行扫描，并取其平均值作为砂糖桔叶片标准样品光谱集中每个样本的原始近红外光谱学数据。2、柑桔黄龙病定性分类判别模型的建立：利用The Unscrambler 9.8分析软件，结合偏最小二乘判别(PLS-DA)法建立柑桔黄龙病病叶定性分类判别模型，并利用移动窗口拟和多项式平滑法(Savitzky-Golay，SG)消除噪声对光谱信号的影响，同时进行一阶求导以消除基线漂移和背景影响。采用随机样本划分法(RS)将分别将感染柑桔黄龙病柑桔叶片样本与不带菌柑桔叶片样本的原始近红外光谱学数据划分出为训练集和验证集，染病柑桔叶片样本121个，其中训练集101个，验证集20个；不带菌柑桔叶片样本176个，其中训练集133个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.标准样品光谱集的建立：采用微型便携式近红外光谱仪于田间直接探测读取感染柑桔黄龙病病菌和不带黄龙病病菌柑桔植株叶片的近红外光谱学数据；S2.定性分类判别模型的建立：将S1中的近红外光谱学数据进行校正和预处理后，分别提取其近红外光谱学的特征值，经训练集训练和验证集验证后得到最优的PLS‑DA定性分类判别模型；S3.未知样品的定性判别：用S2建立的最优的PLS‑DA定性分类判别模型于田间直接区分待测柑桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病。

【技术特征摘要】
1.一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.标准样品光谱集的建立：采用微型便携式近红外光谱仪于田间直接探测读取感染柑桔黄龙病病菌和不带黄龙病病菌柑桔植株叶片的近红外光谱学数据；S2.定性分类判别模型的建立：将S1中的近红外光谱学数据进行校正和预处理后，分别提取其近红外光谱学的特征值，经训练集训练和验证集验证后得到最优的PLS-DA定性分类判别模型；S3.未知样品的定性判别：用S2建立的最优的PLS-DA定性分类判别模型于田间直接区分待测柑桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，光谱仪探测读数的部位为叶片背面的主叶脉，叶龄为当年生或上年生的秋稍成熟叶片。3.根据权利要求1或2所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾鑫年，陈冬梅，王华堂，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44