本发明专利技术提供了一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法，以解决现有小孢子培养技术中小孢子胚胎发生率低、直接成苗率低、培养周期长的问题。通过向诱导培养基NLN中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂—曲古抑菌素A(TSA，TrichostatinA)，以提高白菜小孢子胚胎发生率和直接成苗率。在添加0.025μM~0.10μM TSA的NLN诱导培养基中，白菜的小孢子胚胎发生率提高了1.46~2.48倍，直接成苗率提高了1.12~1.39倍。培养基为NLN培养基+0.025μM~0.10μM TSA+130 g·L‑1蔗糖+100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L‑1、活性炭10g·L‑1的混合液。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及白菜游离小孢子培养方法，属于细胞育种
，是一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法。
技术介绍
白菜（Brassica rapa. ssp. chinensisL.）属典型的十字花科异花传粉植物，有显著的杂种优势。要利用优势杂交育种必须先纯化亲本，传统的连续自交方式所需的时间较长，费工、费力；利用游离小孢子培养方法获得纯合体的时间只需要一年，即节省了时间，又减轻了工作量，并且通过这种方式培育出的再生植株不仅可以创制出新的育种材料，而且植株的世代间稳定性强，杂种优势也强。近几十年国内外一些研究者关于十字花科蔬菜游离小孢子培养做了大量工作，致力于优化小孢子成胚和胚状体成苗体系，但目前尚有许多基因型小孢子的胚胎发生率低以及胚状体成苗率低，限制了这一技术在实际育种工作中的应用范围。TSA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其通过抑制去乙酰化酶的活性来提高组蛋白的乙酰化程度，目前有关TSA的应用主要是在临床抗肿瘤药物或动物胚胎上的作用，其与细胞分化和细胞增殖有关。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过改良白菜游离小孢子培养的培养基配方促进白菜小孢子的胚胎发生及直接成苗的方法，以建立高效的白菜游离小孢子培养体系，为育种工作奠定基础。本专利技术提供的促进白菜小孢子胚胎发生及直接成苗的方法，包括如下步骤：1.选取白菜小孢子发育时期在单核靠边期至双核早期的花蕾，此时花蕾的特征为花瓣长度与花药长度的比值在1/2～3/4之间，用流水冲洗花蕾2～3次后，将花蕾放入灭过菌的100mL烧杯内，用浓度75%乙醇溶液表面灭菌30s，0.1% HgCl2溶液表面灭菌6～8min，无菌水洗涤3次，每次5min，再加入10～15mL含130 g·L-1蔗糖的B5液体培养基，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子游离出来。将含有小孢子的悬浮液先用300目细胞筛过滤，再用500目的细胞筛过滤，收集滤液于50mL离心管中，1000～1200 rpm离心3 min。弃上清液，加入10～15mL含130 g·L-1蔗糖的B5液体培养基，1000～1200 rpm离心3 min，所得沉淀物即为纯净的小孢子。 2.将游离出纯净的小孢子沉淀物用常规的NLN培养基进行稀释培养。在稀释时使细胞密度保持在1×105～2×105个/mL(用血球计数板计数)，将每5 mL小孢子悬浮液分装入为60 mm×15 mm的无菌玻璃培养皿内， 每皿添加100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L-1、活性炭10g·L-1的混合液；添加用二甲基亚砜（DMSO）溶解过滤灭菌后的不同浓度TSA（0、0.025、0.050、0.075、0.100μM）。用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，9～10天后肉眼可见球型胚，连同培养皿转移到25℃摇床上暗培养，摇床转数为50rpm。3.在接种小孢子后第18天转接胚状体到添加30 g·L-1蔗糖，7.5 g·L-1琼脂，0.1g·L-1活性炭的MS培养基上，其pH为5.8～6.0，高温湿热灭菌。接种量为每100mL广口三角瓶含50mL培养基接种3～5个胚状体；于25±1℃，16h小时光照/天条件下培养；15～20天后胚状体发育为根、茎、叶明显健壮的小苗。4.B5培养基配方：pH 5.8～5.84，溶剂为超纯水，溶质及其终浓度分别为(NH4)2SO40.134g·L-1，KNO3 0.25g·L-1，CaCl2·2H2O 0.15g·L-1，MgSO4·7H2O 0.25g·L-1，NaH2PO4·H2O 0.15g·L-1，MnSO4·4H2O 0.01g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.002g·L-1，H3BO30.003g·L-1，Na2MnO4·2H2O 0.00025g·L-1，KI 0.00075g·L-1，CuSO4·5H2O 0.000025g·L-1，CoCl2·6H2O 0.000025g·L-1，VB1 0.01g·L-1，VB6 0.001g·L-1，烟酸0.001g·L-1，肌醇0.1g·L-1，Na2EDTA 0.0373g·L-1，FeSO4·7H2O 0.0278g·L-1，蔗糖130g·L-1，高温湿热灭菌。5.NLN培养基配方：pH 5.8～5.84，溶剂为超纯水，溶质及其终浓度分别为Ca(NO3)2·4H2O 0.025g·L-1，MgSO4·7H2O 0.0625g·L-1，KNO3 0.0625g·L-1，KH2PO40.0625g·L-1，MnSO4·4H2O 0.0223g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.0086g·L-1，H3BO3 0.0062g·L-1，KI 0.00083g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.00025g·L-1，CuSO4·5H2O 0.000025g·L-1，CoCl2·6H2O 0.000025g·L-1，盐酸硫胺素0.005g·L-1，盐酸吡哆醇0.0005g·L-1，肌醇0.1g·L-1，烟酸0.005g·L-1，叶酸0.0005g·L-1，甘氨酸0.002g·L-1，生物素0.00005g·L-1，Na2EDTA0.0373g·L-1，FeSO4·7H2O 0.0278g·L-1，蔗糖130 g·L-1，谷胱甘肽0.03g·L-1，L—丝氨酸0.1g·L-1，L—谷氨酰胺0.8g·L-1，过滤灭菌。 6.MS培养基配方：pH 5.8，溶剂为蒸馏水，溶质及其终浓度分别为NH4NO31.65g·L-1，KH2PO4 0.17g·L-1，KNO3 1.9g·L-1，MgSO4·7H2O 0.37g·L-1，CaCl2 0.33g·L-1，MnSO4·4H2O 0.0169g·L-1，H3BO3 0.0062g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.00025g·L-1，CuSO4·5H2O 0.000025g·L-1，CoCl2·6H2O 0.000025g·L-1，KI 0.00083g·L-1，ZnSO4·7H2O0.0086g·L-1 ，盐酸硫胺素0.0004g·L-1，盐酸吡哆素0.0005g·L-1，烟酸0.0005g·L-1，肌醇0.1g·L-1，甘氨酸0.002g·L-1，Na2EDTA 0.0373g·L-1，FeSO4·7H2O 0.0278g·L-1，蔗糖30g·L-1，琼脂5.5g·L-1，活性炭0.1 g·L-1，高温湿热灭菌。本专利技术的积极效果：1.通过在胚状体诱导阶段在NLN诱导培养基中添加0.025μM ~0.10μM TSA，促进了白菜的小孢子胚胎发生，小孢子胚胎发生率最高达25.14胚/蕾，比对照提高了1.46 ~ 2.48倍。2.从接种白菜小孢子到获得再生植株只需要35天左右，在添加0.025μM TSA的NLN诱导培养基中，白菜的直接成苗率最高，达到了81.51%，在添加0.05μM TSA的NLN诱导培养基中，白菜的直接成苗率次之，达到了78.33%，比对照提高了1.12~1.39倍。3.操作简单易行，只需在诱导阶段加入特定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂—曲古抑菌素A(TSA)，既可以对小孢子的胚发生产生促进作用，又可以对胚状体成苗产生促进作用。附图说明图1 为白菜华冠基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法，其特征包括如下步骤：（1）小孢子培养采用常规白菜游离小孢子培养方法分离纯化小孢子，用含TSA的浓度为0.025μM ~ 0.10 μM NLN培养基培养小孢子，小孢子密度为1×105～2×105个/mL NLN培养基；将每5 mL小孢子悬浮液分装入为60 mm×15 mm的无菌玻璃培养皿内, 每皿添加100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L‑1、活性炭10g·L‑1的混合液，用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，至肉眼可见胚状体后，再转移到转数为50rpm的摇床上继续暗培养；（2）胚状体成苗在接种小孢子后第18天转接胚状体到添加30 g·L‑1蔗糖，7.5 g·L‑1琼脂，0.1 g·L‑1活性炭的MS培养基上，其pH为 5.8～6.0，高温湿热灭菌；接种量为每100mL广口三角瓶含50mL培养基接种5个胚状体；于25±1℃，16h小时光照/天条件下培养；15～20天后胚状体发育为根、茎、叶明显健壮的小苗。
【技术特征摘要】
1.一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法，其特征包括如下步骤：（1）小孢子培养采用常规白菜游离小孢子培养方法分离纯化小孢子，用含TSA的浓度为0.025μM ~0.10 μM NLN培养基培养小孢子，小孢子密度为1×105～2×105个/mL NLN培养基；将每5 mL小孢子悬浮液分装入为60 mm×15 mm的无菌玻璃培养皿内, 每皿添加100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L-1、活性炭10g·L-1的混合液，用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，至肉眼可见胚状体后，再转移到转数为50rpm的摇床上继续暗培养；（2）胚状体...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯辉，张露，章云，唐小燕，刘志勇，李承彧，冀瑞琴，王玉刚，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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