本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种基于FTA卡检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法。步骤如下：纯化收集隐孢子虫卵囊，计数稀释后，定量污染粪便后涂抹于FTA卡上备用；将阳性粪便样品涂抹于FTA卡上备用；用FTA卡收集新鲜粪便备用；在FTA卡上打孔，并洗脱FTA圆片；以清洗好的FTA卡片为DNA模板，以根据隐孢子虫18SrRNA设计的引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明专利技术代替了传统商业化粪便DNA提取试剂盒提取DNA时繁琐的步骤和高昂的价格，具有成本低廉，方便快捷的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种基于FTA卡检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法。
技术介绍
隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的新发人兽共患传染病，被世界卫生组织列为全球六大腹泻病之一。隐孢子虫可以感染包括人在内的280多种动物，其卵囊广泛存在于动物和环境中，常通过水或食物传播造成大规模暴发流行。隐孢子虫病可在奶牛群中广泛传播流行，引起奶牛的体重下降，产奶量减少，给奶牛业的发展造成严重的经济损失，同时能传播多种人畜共患病，存在较高的公共卫生风险，对人和动物健康造成严重威胁。因此快速、简便、准确的发现隐孢子虫是该病防治的关键。目前，隐孢子虫的检测方法有粪便学、免疫学、分子生物学等方法。隐孢子虫的粪便学检查方法，主要有染色法和漂浮法，由于隐孢子虫体积微小，直径在4.5μm-5.5μm，在显微镜下很难辨别，检出率低且易导致误判。目前，国内外已建立了对隐孢子虫病的多种免疫学检测方法，现有的检测方法主要有：酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫荧光法(IFA)、免疫印迹技术(Western blotting)等。随着分子生物学的发展，国内外一些学者相继利用聚合酶链式反应(PCR)、基因芯片等分子生物学技术，对隐孢子虫核酸分子进行了大量的研究，并取得重要进展，且在隐孢子虫卵囊检测、隐孢子虫病的诊断、流行病学调查及虫种鉴定和虫株分型中得到广泛应用。隐孢子虫卵囊DNA的提取量与纯度，直接影响着下游PCR的扩增效果，其DNA的提取主要受卵囊裂解程度和杂质洗脱能力两方面的影响。而奶牛粪便中存在大量肠道脱落上皮细胞、食物残渣、腐殖酸、蛋白质等PCR抑制因子。因此权衡一种最佳的奶牛粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取方法，对粪便隐孢子虫检测有着十分重要的作用。目前国内外主要通过商业化粪便DNA提取试剂盒，来获得奶牛粪便中隐孢子虫卵囊DNA，然而，这种方法提取DNA步骤繁琐，耗时较长，在DNA提取过程中易形成交叉污染，从而影响到检测准确性。此外，使用大量化学试剂，对环境造成污染。FTA(Flinders Technology Associates)是一种经化学特殊处理的棉纤维卡片，目前被广泛应用于目前国内外分子生物学研究的DNA模板制备中。FTA滤膜是将变性剂和螯合剂渗透在纤维基质上，当捕捉到微生物或者细胞后能自动将其裂解，样品DNA吸附在FTA卡上，通过缓冲液洗涤，去除样品中的其他成分，而吸附了DNA的FTA卡可直接作为模板用于PCR反应。而且样品中的传染性病原体在FTA卡上5秒钟内就可完全失活，具有较高的生物安全性。近年来，国内外关于FTA/PCR法检测隐孢子虫卵囊的应用研究仅局限于饮料、地表水等水源性隐孢子虫卵囊，而粪便样品中含有的大量的腐殖酸、食物残渣、脱落的肠道上皮细胞、蛋白质等杂质严重抑制了以FTA卡为DNA模板的PCR扩增。依据Whatman公司推荐的常规洗脱方法无法清洗掉上述PCR抑制因子，清洗掉粪便中的PCR抑制因子是众多研究的方向，但结果都无法较好的达到清洗效果，本专利技术通过添加不同的有机溶剂，改进FTA卡使用说明书中的清洗办法，清洗掉粪便中的PCR抑制因子，让清洗后载有隐孢子虫DNA的FTA卡片可以直接用作DNA模板，来进行后续的PCR扩增等分子生物学研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于FTA/PCR快速高效检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法，具有高敏感度、高生物安全性。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法，步骤如下：(1)纯化收集隐孢子虫卵囊，计数稀释后，定量污染粪便后涂抹于FTA卡上备用；(2)将阳性粪便样品涂抹于FTA卡上备用；(3)用FTA卡收集新鲜粪便备用；(4)在步骤(1)、(2)和(3)中的FTA卡上打孔，并洗脱FTA圆片；(5)以清洗好的FTA卡片为DNA模板，以根据隐孢子虫18SrRNA设计的引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。所述步骤(1)中纯化收集方法采用饱和盐水漂浮法和氯化铯梯度离心法共同作用，定量污染指将收集的卵囊稀释成1×10-1/mL-1×105/mL个卵囊悬液，取1mL混入1g粪便中。所述步骤(2)中阳性粪便指安氏隐孢子虫阳性粪便、贾第虫阳性粪便、微孢子虫阳性粪便或球虫阳性粪便中的两种或两种以上。所述步骤(4)中洗脱步骤为：a.将获得的FTA圆片分别放入离心管内，加去污剂溶液煮沸5min，弃去污剂溶液，加无水乙醇清洗5min，期间数次轻微震荡，然后弃去无水乙醇；b.加入300μL Whatman公司的FTA卡清洗液，室温孵育5min，加入500μL1×TE溶液，室温孵育5min；c.重复步骤b一次，将清洗后的FTA圆片室温放置1小时或在56℃温箱中10min，至FTA圆片完全干燥，供后续试验。所述步骤a中去污剂为质量分数10％的SDS溶液，加入无水乙醇的体积为500μL。所述步骤(5)中PCR扩增采用巢氏PCR，反应体系为50μL。一种FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法用于基因型为C.parvum、C.andersoni、C.bovis或C.rynane的隐孢子虫卵囊的检测。本专利技术的有益效果在于：(1)FTA卡与巢氏PCR结合后提高了检测敏感度，最低检测量可达1×101个卵囊/克粪便；(2)操作简便，只需携带FTA卡到养殖场采集粪便样本后，经FTA洗脱液和其他有机溶液清洗后，即可将FTA卡片用作DNA模板进行PCR扩增；(3)具有较高的生物安全性，FTA卡特有的螯合剂和裂解剂可以短时间迅速使微生物和寄生虫卵囊失去活性，降低了有害病原的传播机会，保护了实验操作人员的安全，具有较高的公共卫生意义；(4)FTA卡的常规洗脱方法，无法清洗粪便中的PCR抑制因子，本专利技术通过添加不同的有机溶剂，改进FTA卡使用说明书中的清洗办法，清洗掉了粪便中的PCR抑制因子，使清洗后载有隐孢子虫DNA的FTA卡片可直接用作DNA模板，进行后续的PCR扩增等分子生物学研究，本专利技术代替了传统商业化粪便DNA提取试剂盒提取DNA时繁琐的步骤和高昂的价格，具有成本低廉，方便快捷的优点。附图说明图1为隐孢子虫巢式PCR反应条件示意图。图2为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫:阳性粪便样品的敏感性试验电泳图；其中，M表示DNA Marker(DL2000)；泳道1-7：1×105-1×10-1个卵囊/g隐孢子虫阳性粪便样品；P：阳性对照；N：阴性对照。图3为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫:阳性粪便样品的特异性试验电泳图；其中，M表示DNA Marker(DL2000)；泳道1：微小隐孢子虫阳性粪便样品；泳道2：安氏隐孢子虫阳性粪便样品；泳道3：贾第虫阳性粪便样品；泳道4：微孢子虫阳性粪便样品；泳道5：球虫阳性粪便样品；泳道6：含双蒸水粪便样品；P：阳性对照；N：阴性对照。图4为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫:阳性粪便样品的重复性试验电泳图；其中，M表示DNA Marker(DL2000)；泳道1-5：巢式PCR第一套产物电泳图；泳道6-N：巢式PCR第二套产物电泳图；泳道1-3、6-8：隐孢子虫阳性粪便样品；4、P：阳性对照；9、N：阴性对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法，其特征在于：步骤如下：（1）纯化收集隐孢子虫卵囊，计数稀释后，定量污染粪便后涂抹于FTA卡上备用；（2）将阳性粪便样品涂抹于FTA卡上备用；（3）用FTA卡收集新鲜粪便备用；（4）在步骤（1）、（2）和（3）中的FTA卡上打孔，并洗脱FTA圆片；（5）以清洗好的FTA卡片为DNA模板，以根据隐孢子虫18SrRNA设计的引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
【技术特征摘要】
1.一种FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法，其特征在于：步骤如下：（1）纯化收集隐孢子虫卵囊，计数稀释后，定量污染粪便后涂抹于FTA卡上备用；（2）将阳性粪便样品涂抹于FTA卡上备用；（3）用FTA卡收集新鲜粪便备用；（4）在步骤（1）、（2）和（3）中的FTA卡上打孔，并洗脱FTA圆片；（5）以清洗好的FTA卡片为DNA模板，以根据隐孢子虫18SrRNA设计的引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。2.如权利要求1所述的FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法，其特征在于：所述步骤（1）中纯化收集方法采用饱和盐水漂浮法和氯化铯梯度离心法共同作用，定量污染指将收集的卵囊稀释成1×10-1/mL-1×105/mL个卵囊悬液，取1mL混入1g粪便中。3.如权利要求1所述的FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法，其特征在于：所述步骤（2）中阳性粪便指安氏隐孢子虫阳性粪便、贾第虫阳性粪便、微孢子虫阳性粪便或球虫阳性粪便中的两种或两种以上。4.如权利要求1所述的FTA\...
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣军，张振杰，张龙现，张素梅，王海燕，菅复春，宁长申，胡苏辉，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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