一种斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法，其包括如下步骤：(1)、将地塞米松用DMSO溶解，制成浓度为12.5‑40mg/ml地塞米松母液；(2)、将地塞米松母液加入至盛有斑马鱼仔鱼的培养液中，使培养液中的地塞米松的终浓度为12.5‑40μg/ml；(3)、将斑马鱼仔鱼置于恒温培养箱内进行培养，以诱导斑马鱼仔鱼肝肿大。本发明专利技术提供的斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法能够有效诱导斑马鱼仔鱼肝肿大，可用于鱼类肝肿大药物的筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鱼类肝肿大模型的构建方法，具体涉及一种斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法。
技术介绍
以肝肿大为主要特征的鱼类肝胆综合症是目前水产养殖中日趋严重的病害，其发病范围广，死亡率高，给水产养殖业造成了极大的经济损失。鱼类肝胆综合症属于非传染性疾病，常用的抗生素和抗病毒药物不能有效地控制鱼类肝胆综合症，寻找、筛选有效的鱼类肝胆综合症药物已经成为鱼类疾病研究领域的热点。为了实现抗鱼类肝肿大药物的筛选，首先需要构建鱼类肝肿大模型。目前，尚未发现有关鱼类肝肿大模型的构建方法，尤其是仔鱼肝肿大模型的构建方法的相关报道。斑马鱼具有个体小，繁殖快，培育方便，培育费用低等特点。斑马鱼的肝脏在鱼卵受精后72小时就已经发育完全，而且斑马余的胚胎和仔鱼都是透明的，可在显微镜下清楚地观察到其肝脏大小的变化，因此斑马鱼仔鱼是理想的肝毒模型动物，已被国内外学者应用于环境毒理及人类药物毒理研究。地塞米松是一种人工合成的糖皮质激素，研究表明，其对哺乳动物的肝肿大有一定的诱导作用。但目前尚未发现采用地塞米松诱导鱼类肝肿大的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供了一种斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法，其可用于鱼类肝肿大药物的筛选。本专利技术的技术方案如下：一种斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)、将地塞米松用DMSO溶解，制成浓度为12.5-40mg/ml地塞米松母液；(2)、将地塞米松母液加入至盛有斑马鱼仔鱼的培养液中，使培养液中的地塞米松的终浓度为12.5-40μg/ml；(3)、将斑马鱼仔鱼置于恒温培养箱内进行培养，以诱导斑马鱼仔鱼肝肿大。培养液中的地塞米松的终浓度低于12.5μg/ml，斑马鱼仔鱼的肝肿大不显著；培养液中的地塞米松的终浓度高于40μg/ml，则会引起斑马鱼仔鱼发育异常。作为本专利技术的进一步改进，所述地塞米松母液中的地塞米松的浓度为12.5mg/ml。作为本专利技术的进一步改进，所述地塞米松母液中的地塞米松的浓度为25mg/ml。作为本专利技术的进一步改进，所述培养液中的地塞米松的终浓度为12.5μg/ml。作为本专利技术的进一步改进，所述培养液中的地塞米松的终浓度为25μg/ml。作为本专利技术的进一步改进，所述斑马鱼仔鱼为受精后72-120小时的斑马鱼仔鱼。受精后的时长短于72小时，斑马鱼仔鱼的肝脏尚未发育完全；由于斑马鱼仔鱼以卵黄囊为营养，受精后的时长长于120小时，卵黄囊变小，营养供应不足，会影响肝脏的发育。作为本专利技术的进一步改进，所述恒温培养箱内的温度设定为28℃，培养时长为24-48小时。培养时长短于24小时，斑马鱼仔鱼的肝肿大不显著；培养时间长于48小时则会引起斑马鱼仔鱼发育异常。与现有技术相比，本专利技术的技术效果在于：能够有效地诱导斑马鱼仔鱼肝肿大，可用于鱼类肝肿大药物的筛选。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的物料配比、工艺条件及其结果仅用于本专利技术，而不应当也不限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1、用5ml浓度为12.5μg/ml的地塞米松培养液构建斑马鱼仔鱼肝肿大模型，具体步骤如下：称取2mg地塞米松于enpendoff管中，加入160μl的二甲基亚砜(DMSO)，制成浓度为12.5mg/ml的地塞米松母液；取6cm培养皿，用移液器移入5ml含15尾左
右斑马鱼仔鱼的培养液，加入5μl浓度为12.5mg/ml的地塞米松母液于培养皿中，轻轻摇晃均匀，使培养液中地塞米松的浓度为12.5μg/ml；将培养皿置入恒温箱中，设定培养温度为28℃，培养时长为24小时。实施例2、用30ml浓度为25μg/ml的地塞米松培养液构建斑马鱼仔鱼肝肿大模型，具体步骤如下：称取2mg地塞米松于enpendoff管中，加入80μl的二甲基亚砜(DMSO)，制成浓度为25mg/ml的地塞米松母液；取15cm培养皿，用移液器移入30ml含60尾左右斑马鱼仔鱼的培养液，加入30μl浓度为25mg/ml的地塞米松母液于培养皿中，轻轻摇晃均匀，使培养液中地塞米松的浓度为25μg/ml；将培养皿置入恒温箱中，设定培养温度为28℃，培养时长为24小时。1、实验设计：以不含地塞米松的斑马鱼培养液为对照组(CK)，对照组(CK)培养斑马鱼仔鱼的步骤如下：取相同大小的培养皿(6cm或15cm)，用移液器移入(5ml或30ml)含斑马鱼仔鱼(15尾或60尾左右)的培养液，加入5μl或30μl DMSO于培养皿中，轻轻摇晃均匀；将培养皿置入恒温箱中，设定培养温度为28℃，培养时长为24小时。分别从对照组(CK)、实施例1及实施例2中培养的斑马鱼仔鱼中随机挑选10条，并测量肝脏面积，取三组的平均值。测量斑马鱼仔鱼的肝脏的面积的方法如下：用3％羧甲基纤维素钠固定斑马鱼仔鱼，然后用显微镜对斑马鱼仔鱼进行拍照，最后使用adobe photoshop软件测量斑马鱼仔鱼的肝脏面积。本实验中的所用的受精后120小时的斑马鱼仔鱼的孵化过程如下：在采卵的前一天的下午17点，将性成熟的斑马鱼按雌雄比例1：1放入交配缸中，雄性斑马鱼与雌性斑马鱼被交配缸中间的隔板隔开；晚上21点关闭灯光，使得交配缸处在黑暗的环境中；第二天上午9点，去掉隔板，让雌雄斑马鱼自由交配，约30分钟后收集受精卵并放入孵化箱中孵化120个小时，获得斑马鱼仔鱼。2、实验结果比较将对照组(CK)、实施例1及实施例2中的10尾斑马鱼仔鱼的肝脏面积用SPSS
软件单因素方差分析(One way-ANOVA)处理，用t检验比较各组平均值的差异(比较之前，对斑马鱼仔鱼肝脏面积进行归一化处理，对照(CK)的平均值取为1)，P<0.05表示差异显著，结果以平均值±标准误表示(表1)：表1.不同培养液诱导斑马鱼仔鱼肝肿大模型对斑马鱼仔鱼的肝肿大的影响对照组(CK)实施例1实施例2平均肝脏面积1±0.021.15±0.04*1.2±0.04*从表1中的数据比较可见，本专利技术培养的斑马鱼仔鱼的肝脏面积显著大于对照(CK)培养的斑马鱼仔鱼的肝脏面积，说明本专利技术的诱导斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法能够有效诱导斑马鱼仔鱼肝肿大，进而也说明了一定浓度的地塞米松能够有效诱导鱼类的肝肿大。上文对本专利技术进行了足够详细的具有一定特殊性的描述。所属领域内的普通技术人员应该理解，实施例中的描述仅仅是示例性的，在不偏离本专利技术的真实精神和范围的前提下做出所有改变都应该属于本专利技术的保护范围。本专利技术所要求保护的范围是由所述的权利要求书进行限定的，而不是由实施例中的上述描述来限定的。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)、将地塞米松用DMSO溶解，制成浓度为12.5‑40mg/ml地塞米松母液；(2)、将地塞米松母液加入至盛有斑马鱼仔鱼的培养液中，使培养液中的地塞米松的终浓度为12.5‑40μg/ml；(3)、将斑马鱼仔鱼置于恒温培养箱内进行培养，以诱导斑马鱼仔鱼肝肿大。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)、将地塞米松用DMSO溶解，制成浓度为12.5-40mg/ml地塞米松母液；(2)、将地塞米松母液加入至盛有斑马鱼仔鱼的培养液中，使培养液中的地塞米松的终浓度为12.5-40μg/ml；(3)、将斑马鱼仔鱼置于恒温培养箱内进行培养，以诱导斑马鱼仔鱼肝肿大。2.如权利要求1所述的斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法，其特征在于，所述地塞米松母液中的地塞米松的浓度为12.5mg/ml。3.如权利要求1所述的斑马鱼仔鱼肝肿大模型的构建方法，其特征在于，所述地...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷国俊，寺岡宏樹，曹丽萍，杜金梁，贾睿，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32