一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法，包括：根据筛选抗耐何种重金属，取长期污染该重金属的土样；根据筛选微生物种类选择适宜培养基；取样品，加入到液体培养基的三角瓶中进行微生物的富集培养，200r/min28℃振荡24h；配置不同梯度浓度重金属离子的适于微生物生长的液体培养基；取富集培养微生物样品1mL加入到不同梯度浓度重金属离子液体培养基中，200r/min28℃振荡24h；取低于致死浓度重金属离子液体培养基样品500μL涂布于微生物生长的固体培养基；挑取单菌落到相应浓度重金属离子固体培养基复筛；获得稳定的抗耐高浓度重金属微生物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境微生物领域，尤其涉及一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法。
技术介绍
近年来随着工农业的迅速发展和人类活动范围的不断扩大，土壤重金属污染问题日益突出。土壤重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，而且毒性大，不仅影响作物的正常生长发育从而降低产量和品质，并且会通过食物链危害人体健康。我国土壤重金属污染物主要来源于污水灌溉、工业废渣、城市垃圾、工业废弃物堆放及大气沉降，同时中国是一个资源大国，具有非常丰富的矿产资源，这些矿产资源的开发和利用对于经济和社会发展具有极其重要的作用。但在对这些资源进行开发的同时，重金属也污染到了周围土壤。目前，传统的土壤重金属污染治理方法主要有：基于机械物理或物理化学原理的工程措施，如换土法、隔离法、清洗法、热处理法、电化学法等；基于污染物化学行为的改良措施，如添加改良剂、抑制剂降低土壤污染物的水溶性、扩散性和生物有效性。但这些技术具有投入大，易产生二次污染等缺点。微生物修复技术是指利用特定的微生物吸收、转化、清除或降解土壤重金属污染物实现土壤净化的生物措施。该技术可以使重金属污染物从土壤中去除，对周围环境影响较小，不会产生二次污染，具有的巨大土壤修复潜力。如何高效获得抗耐高浓度重金属微生物？
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法，该方法包括取样、培养基配置、微生物富集培养、含不同梯度浓度重金属离子液体培养基配置、初筛、复筛等六大方面。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术措施：一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法：(1)取样根据筛选抗耐何种重金属，取长期污染该重金属的土样。(2)培养基配置由于各类微生物对营养条件的需求不尽相同，需要根据其对营养元素的要求选择适当配方。因此，根据筛选微生物种类选择适宜培养基。(3)微生物富集培养取10g样品，加入到装有90mL液体培养基的三角瓶中进行微生物的富集培养，200r/min
28℃振荡24h。所述的液体培养基为根据样品中的微生物种类所选取的液体培养基。(4)含不同梯度浓度重金属离子液体培养基配置查阅相关文献，配置不同梯度浓度重金属离子适于微生物生长的液体培养基。(5)初筛取富集培养微生物样品1mL加入到不同梯度浓度重金属离子液体培养基中，200r/min 28℃振荡培养；间隔6-8h取出菌液，紫外分光光度计测定OD600，多次测定OD600值没有增长变化的重金属离子浓度即为该样品中微生物重金属致死浓度。(6)复筛取低于微生物重金属致死浓度下一个浓度样品500μL涂布于微生物生长的固体培养基，挑取单菌落到相应浓度重金属离子固体培养基复筛，获得稳定的抗耐高浓度重金属微生物。本专利技术与常规种植技术相比，具有以下优点和效果：目前技术筛选土壤抗耐重金属微生物方法为传统的稀释涂布方法。大致分为：①土壤稀释液制备；②涂布接种：按梯度稀释的培养液接种到培养机上进行恒温培养；③初次筛选：在平板上挑取具有一定特征的菌落进行纯化；④复筛：进行多次纯化得到纯培养。本专利技术大大提高了筛选新颖抗耐重金属菌株的几率。传统稀释涂布法根据个人主观观察挑单菌落数量有限，而本方法通过共培养的方式筛选抗耐重金属菌株，土壤中所有微生物都参与其中。本专利技术利于快速筛选到目的菌株。一是所取土样是长期重金属污染的土壤，该土壤中抗耐重金属微生物种类多、降解污染物的潜力巨大，能够快捷筛选到抗耐重金属菌株，且该抗耐重金属菌株应用安全，适应性好，无二次污染。二是将土壤微生物接种于不同梯度浓度重金属液体培养基中，只需要十几个小时就可以检测到结果；与以往将微生物接种于固体培养基上静置培养，需要较长时间(一般需要两天到一周时间)相比优势明显。整个筛选过程操作简单，劳动强度较小，能够快速、直观、高效的筛选到抗耐重金属菌株。具体实施方式本专利技术实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均为实现本专利技术。实施例1：本专利技术申请人采取上述几项措施，筛选水稻田抗耐镉菌株，获得较为理想的效果。一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法：(1)取样采集大冶罗家桥乡陈家嘴湾镉污染水稻田土。采用三点取样法，在取样地取5-20cm的表层土，放入自封袋中，4℃条件保存备用。(2)培养基配置本实施例根据样品中微生物种类，选取了两种培养基，具体如下：异养厌氧细菌固体培养基(高泽有机氮琼脂培养基，pH7.2)：葡萄糖10g、蛋白胨5g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1L。琼脂15g。异养厌氧细菌液体培养基(高泽有机氮琼脂培养基，pH7.2)：葡萄糖10g、蛋白胨5g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1L。真菌固体培养基(马丁培养基，pH7.0)：葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、水1L、10g/L孟加拉红溶液3.3mL、琼脂18g(注：由于链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基溶化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1％的溶液，在100ml培养基中加1％链霉素液0.3ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg，以抑制细菌的生长。10g/L孟加拉红溶液配置：10g孟加拉红定容到1升。)真菌液体培养基(马丁培养基，pH7.0)：葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、水1L、10g/L孟加拉红溶液3.3mL。(3)微生物富集培养取10g土样，加入到装有90mL液体培养基的三角瓶中进行微生物的富集培养，200r/min28℃振荡24h。所述的液体培养基为异养厌氧细菌液体培养基或真菌液体培养基。(4)含不同梯度浓度重金属离子液体培养基配置称取11.42g CdCl2·2.5H2O，加入25mL蒸馏水中溶解，即浓度为1mol/L。准确吸取1mol/L镉标准溶液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL，0.9mL，1.0mL，1.2mL，1.3mL，1.4mL，1.5mL分别于150mL的三角瓶中，三角瓶中加异养厌氧细菌液体培养基或真菌液体培养基99mL，即粗略得到含镉浓度为1mmol/L，2mmol/L，3mmol/L，4mmol/L，5mmol/L，6mmol/L，7mmol/L,8mmol/L，9mmol/L，10mmol/L，11mmol/L，12mmol/L，13mmol/L，14mmol/L，15mmol/L的培养基。(5)初筛取富集培养微生物样品1mL加入到不同梯度浓度重金属离子液体培养基中，200r/min28℃振荡培养；间隔6-8h取出菌液，紫外分光光度计测定OD600，真菌在Cd+浓度为13mmol/L
的液体培养基OD600没有变化，细菌在Cd+浓度为7mmol/L的液体培养基OD600没有变化。(6)复筛取真菌在Cd+浓度为12mmol/L的培养液500μL涂布于真菌生长的真菌固体培养基，挑取单菌落到Cd+浓度为12mmol/L重金属离子固体培养基复筛，获得稳定的抗耐Cd+浓度为12mmol/L的真菌菌株4个。取细菌在Cd+浓度为6mmol/L的培养液500μL涂布于细菌生长的异养厌氧细菌固体培养基，挑取单菌落到Cd+浓度为6mmol/L重金属离子固体培养基复筛，获得稳定的抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法，其步骤是：（1）取样根据筛选抗耐何种重金属，取长期污染该重金属的土样；（2）培养基配置根据筛选微生物种类选择适宜培养基；（3）微生物富集培养取10g样品，加入到装有90mL液体培养基的三角瓶中进行微生物的富集培养，200r/min 28℃振荡24h；（4）含不同梯度浓度重金属离子液体培养基配置配置不同梯度浓度重金属离子适于微生物生长的液体培养基；（5）初筛取富集培养微生物样品1mL加入到不同梯度浓度重金属离子液体培养基中，200r/min 28℃振荡培养；间隔6‑8h取出菌液，紫外分光光度计测定OD600，多次测定OD600值没有增长变化的重金属离子浓度即为该样品中微生物重金属致死浓度；（6）复筛取低于微生物重金属致死浓度下一个浓度样品500μL涂布于微生物生长的固体培养基，挑取单菌落到相应浓度重金属离子固体培养基复筛，获得稳定的抗耐高浓度重金属微生物。

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选抗耐高浓度重金属微生物的方法，其步骤是：（1）取样根据筛选抗耐何种重金属，取长期污染该重金属的土样；（2）培养基配置根据筛选微生物种类选择适宜培养基；（3）微生物富集培养取10g样品，加入到装有90mL液体培养基的三角瓶中进行微生物的富集培养，200r/min 28℃振荡24h；（4）含不同梯度浓度重金属离子液体培养基配置配置不同梯度浓度重金属离子适于微生物生长的液体培养基；（5）初筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁自立，吴金平，周庆新，陈磊夫，邱正明，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，山东省农业科学院农产品研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42