一种提高γ‑谷氨酰转肽酶表达量的方法，主要是将GGT基因3′末端终止子后添加形式为AAA,AAAAAA,TTTAAA,AAATTTAAA,TTTAAATTTAAA,TTTAAAAAAAAA的poly(A/T)尾巴，提高其在钝齿棒杆菌中的表达量，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术在于通过在GGT基因3′末端终止子后添加形式为TTTAAA的poly(A/T)尾巴，发现与不添加poly(A/T)尾巴的对照菌相比，GGT在钝齿棒杆菌中的表达量提高了2倍多，这说明添加形式为TTTAAA的poly(A/T)尾巴有利于提高GGT在钝齿棒杆菌中的表达量。
【技术实现步骤摘要】
一种提高γ-谷氨酰转肽酶表达量的方法，主要是通过基因工程技术提高γ-谷氨酰转肽酶的表达量，属于基因工程和酶工程领域。技术背景L-茶氨酸，化学名称为N-乙基-γ-L-谷氨酰胺，是一种几乎只存在于茶类植物中的游离氨基酸，决定茶叶的风味和品质。茶氨酸具有多种重要的生理功能：放松减压作用；降血压作用；抑制咖啡因引起的兴奋反应；提高学习能力；抗肿瘤；控制体重等。早在1985年美国食品和药物管理局(FDA)已经认证L-茶氨酸为一般公认安全的物质(GRAS)，在食品中使用沒有特定用量限制。鉴于茶氨酸上述诸多生理功效及其绝对安全性，其作为一种食品组分及饮品添加剂的需求量日益增加。进入21世纪，酶法转化合成以其优越性日益受到青睐，因此研究人员重心也集中于酶法合成L-茶氨酸，可用于合成茶氨酸的酶包括谷氨酰胺合成酶，谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)。谷氨酰胺合成酶受ATP供应限制，谷氨酰胺酶产物对底物的转化率低，γ-谷氨酰转肽酶脱颖而出。γ-谷氨酰转肽酶分布广泛，负责催化谷胱甘肽及其类似物的γ-谷氨酰键的断裂，并将生成的γ-谷氨酰基团转移给水(此时即为水解反应)或者其他氨基酸(转肽反应)。利用GGT的转肽功能，选定L-谷氨酰胺和乙胺作为供体和受体时，即可实现酶法生成L-茶氨酸。酶法催化中生产菌株的选育至关重要。目前γ-谷氨酰转肽酶的表达多选用大肠杆菌体系，江南大学吴敬教授课题组利用大肠杆菌的分泌型质粒实现了GGT蛋白的胞外分泌，但是该大肠杆菌宿主表达体系仍存在一定的安全隐患。申请人前期成功在B.subtilis中实现了该蛋白的过量表达，胞外获得可观的蛋白酶含量。上述研究为我们实验提出了要求和思路：生产菌株的绝对安全性和目的蛋白能否在宿主菌中实现胞外分泌。钝齿棒杆菌SDNN403(保藏编号CGMCC0890，专利号为：ZL 03112896.3)是经过多级诱变筛选获得、适用于多种氨基酸高产的安全菌株，具备高效表达外源蛋白的潜力。申请人前期利用pXMJ19质粒，实现了B.subtilis 168来源的GGT基因在C.crenatum SDNN403的表达。同时发现GGT蛋白的信号肽片段可以在钝齿棒杆菌中被识别，从而引导该目的蛋白分泌到胞外，胞外GGT活力为10.31U/mL，并申请了相关专利(申请号201610454875.8)，但是，相比于工业化生产要求，该酶的表达量偏低，会增加上游生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于前期申请的专利(申请号201610454875.8)相关内容为基础，提供一种进一步提高GGT在钝齿棒杆菌中表达量的方法，具体内容是将GGT基因3′末端终止子后添加形式为AAA,AAAAAA,TTTAAA,AAATTTAAA,TTTAAATTTAAA,TTTAAAAAAAAA的poly(A/T)尾巴，提高其在钝齿棒杆菌中的表达量，为钝齿棒杆菌作为宿主表达外源蛋白及茶氨酸的生产均提供了有益的指导。本专利技术的技术方案：1.重组质粒pXMJ19-tacM-ggtM的构建ggt-F:CGCGGATCCAAAGGAGGGAAATCATGAAAAGAADGTGGAACTCT(BamH I)ggt-R1:CCGGAATTCTTTTTATTTACGTTTTAAATTAATGCCG(EcoR I)ggt-R2:CCGGAATTCTTTTTTTTATTTACGTTTTAAATTAATGCCG(EcoR I)ggt-R3:CCGGAATTCAAATTTTTATTTACGTTTTAAATTAATGCCG(EcoR I)ggt-R4:CCGGAATTCTTTAAATTTTTATTTACGTTTTAAATTAATGCCG(EcoR I)ggt-R5:CCGGAATTCAAATTTAAATTTTTATTTACGTTTTAAATTAATGCCG(EcoR I)ggt-R6:CCGGAATTCAAATTTTTTTTTTTATTTACGTTTTAAATTAATGCCG(EcoR I)以申请人前期申请的专利(申请号201610454875.8)所公开的pXMJ19-tacM-ggt载体为模板，选用PrimerSTAR HS高保真酶，利用引物ggt-F和引物ggt-R1-6中一条为引物分别对应扩增出6条目标基因片段ggtM(1-6)，分别将胶回收获得的上述6条DNA片段ggtM1-6与申请人前期申请的专利(申请号201610454875.8)所公开的pXMJ19-tacM载体连接，获得6个重组质粒pXMJ19-tacM-ggtM(1-6)。2突变GGT在钝齿棒杆菌SDNN403中的表达将构建好的6个重组质粒pXMJ19-tacM-ggtM(1-6)分别单个电转化法转化至C.glutamicum SDNN403感受态中，在氯霉素抗性平板上筛选阳性重组子，提取质粒进行酶切验证，验证正确即为构建成功的重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggtM(1-6)。上述菌株分别接种至含有10μg/mL氯霉素的LBG液体培养基中30℃培养过夜，次日以10％的接种量转接至25mL的钝齿发酵培养基中培养，添加IPTG终浓度为0.8mM进行诱导表达，完整培养周期为96h。培养结束后8000rpm离心20min，收集上清液即为胞外酶液，4℃保存。细胞沉淀用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次，重悬浮于该缓冲液中，超声波破碎仪破碎细胞。10000rpm离心30min去除沉淀细胞碎片，上清即为胞内蛋白液，置于4℃保存。均用于后续GGT的酶活测定。4 GGT酶活力的测定GGT转肽酶活的测定原理是利用酶的转肽功能，催化底物γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GpNA)的γ-谷氨酰基团转移到受体双甘二肽，随之生成的对硝基苯胺在410nm处有特殊吸收，通过测定该反应生成的对硝基苯胺的浓度来衡量GGT酶活力。1mL反应体系中包含：50mmol/L硼酸-NaOH缓冲液(pH 10.0)，2.5mmol/Lγ-GpNA，60mmol/L双甘二肽，20μL适当稀释的酶液。37℃反应10min后，添加125μL浓度为3.5mol/L的醋酸终止反应。以不添加双甘二肽受体的反应液作为对照，其他处理均和实验组相同，410nm处测定吸光度差值。酶活单位定义为：1min内经由转肽反应催化生成1μmol对硝基苯胺(p-Nitrophenylamine)所需酶量即为一个酶活单位(U)。本专利技术的有益成果：本实验实现了B.subtilis 168来源的GGT基因在C.glutamicum SDNN403的高效表达。C.glutamicum SDNN403是一株适合于氨基酸生产的安全菌株，其细胞培养可以达到的高密度水平也使其具备作为宿主菌表达外源蛋白的潜能，因此该表达系统不但可以满足工业生产的安全性，而且可以满足工业生产的强度。附图说明无具体实施方法下面结合实施例，对本专利技术进一步说明。实施例1：重组质粒pXMJ19-tacM-ggtM的构建ggt-F:CGCGGATCCAAAGGAGGGAAATCATGAAAAGAADGTGGAACTCT(BamH I)ggt-R1:CCGGAATTCTTTTTATTTACGTTTTAAATTAATGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高γ‑谷氨酰转肽酶表达量的方法，其特征是，在GGT基因3′末端终止子后添加poly(A/T)尾巴，并将带有poly(A/T)尾巴的γ‑谷氨酰转肽酶基因导入微生物体内进行发酵培养生产γ‑谷氨酰转肽酶。
【技术特征摘要】
1.一种提高γ-谷氨酰转肽酶表达量的方法，其特征是，在GGT基因3′末端终止子后添加poly(A/T)尾巴，并将带有poly(A/T)尾巴的γ-谷氨酰转肽酶基因导入微生物体内进行发酵培养生产γ-谷氨酰转肽酶。2.权利要求1所述的poly(A/T)尾巴碱基序列，优选但不限于TTTAAA。3.一种提高γ-谷氨酰转肽酶在重组钝齿棒杆菌表...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，杨套伟，徐美娟，张显，和斐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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