分级分离方法技术

一种从制剂纯化IgG抗体的方法，其包括提供相比于从中获得所述制剂的样品的染色质水平具有显著降低的染色质水平的形式的所述制剂，和使所述制剂与正电膜接触，所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少50％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过，其中所述所选大小为约10nm到约15nm，其中在所述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得(1)当以小于50mM的浓度存在时，pH值在约3到所述制剂中的所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的0.5个pH单位内的范围；或(2)当以大于50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在3到9的范围；以及将操作条件调节为不导致超过5％的所述抗体结合到所述膜的最高pH值和最低盐浓度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求于2014年2月19日提交的美国临时专利申请号61/941,911的优先权，其全部公开内容以引用方式并入本文中。
技术介绍
本文所公开的实施方案涉及用于纯化抗体、特别是IgG抗体的方法。阴离子交换色谱已被用于纯化IgG抗体，因为它选择性地结合酸性污染物，而IgG微弱地结合阴离子交换剂表面，完全不结合阴离子交换剂表面，或者它从阴离子交换剂表面被排斥。这提供了从抗体中消除酸性污染物的一种方便有效的手段。阴离子交换色谱的通常实施的示例包括：向含IgG的样品中大量添加带正电荷的聚合物或粒子、使所述样品通过呈流通或空隙排阻模式的填充有阴离子交换粒子的柱；或高效正切流动过滤技术，其中在极低的盐浓度下仅仅通过它们与膜的表面上的带正电荷的基团的静电排斥而阻止抗体通过膜孔。除以空隙排阻模式操作的粒子填充柱上的阴离子交换(R.Nian等，J.Chromatogr.A 1282(2013)127-132)以外，所有阴离子交换方法均需要首先将样品平衡到适于结合污染物的化学条件。这限制了阴离子交换的适用性，因为它意味着来自先前分级分离步骤的样品必须在被施加到阴离子交换剂之前进行缓冲液交换，以使所述条件适于实施所述技术。更高限制性的选择是，必须对先前的分级分离步骤本身进行选择，以使得在完成所述分级分离步骤时被加工的IgG已经被提供在适于施加到阴离子交换剂的条件下。这些限制特别加重了其中IgG抗体处于高盐环境下的纯化过程顺序的负担，例如跟着阳离子交换色谱步骤、或多模式(阳离子交换-疏水相互作用、或羟基磷灰石步骤)，或者加重了其中盐已出于任何原因被添加到样品中的纯化过程顺序的负担。已经描述了用于加工特别去除了染色质分解代谢产物的含IgM抗体的细胞培养收获物的方法((Gan等J.Chromatogr.A,1291(2013)33-40)。这些方法特别描述了在大致生理条件下使用DNA嵌入化合物依沙吖啶澄清含IgG的细胞培养收获物。通过污染物与辛酸共沉淀对单克隆IgG抗体的部分纯化已被公开(Chantuin,A.等，Arch.Biochem.Biophys.89(1960)218-220)。所述脂肪酸结合所有蛋白质，但选择性地沉淀非IgG污染物(Gagnon,P.,purification Tools for Monoclonal Antibodies,1996,Validated Biosystems,Tucson；Morais,V.等，Biotechnol.Appl.Biochem.,59(2012)50-54)。已经指明用于应用于无细胞的细胞培养收获物的工艺开发指南(Gagnon见上文)。已经描述将辛酸应用于含细胞的细胞培养收获物(Brodsky等Biotechnol.Bioeng.109(2012)2589-2598)。所述技术具有共同产生干扰进一步纯化的浑浊、粘性、电负性浑浊物的不适当的特征(Gagnon见上文；Brodsky等，见上文)。尿囊素是经FDA批准的广泛用于非处方卫生保健产品中的炎性因子。已知它可以从蛋白质溶液(包括从IgG溶液)去除内毒素(V.Vagenende等，ACS.Appl.Mater.Interfaces,22(2013)4472-4478；V.Vagenende等，J.Chromatogr.A 1310(2013)15-20)。
技术实现思路
在某些方面，本专利技术提供了从含有IgG抗体和污染物的制剂纯化所述抗体的方法，优选地其中所述制剂已被加工，以去除至少95％的存在于从中得到所述制剂的原始生产介质中的染色质。该方法包括使所述制剂与正电膜接触的步骤，所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少50％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所选大小的未被吸附的溶质通过，并且所选大小可以是约10nm到约15nm的任何量。在所述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得(1)当所述盐以小于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到所述制剂中的IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围；或(2)当所述盐以大于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到约9
的范围。接触步骤的最终操作条件由以下来限定：所述制剂中不存在过量盐或所述制剂不大于20mM的非零盐浓度，以及在约5到IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围的pH值。在某些实施方案中，向所述方法提供的所述制剂为具有降低的染色质水平的形式，使得所述制剂中的染色质的量是原来存在于从中获得所述制剂的来源样品中的染色质的量的小于约5％。在某些方面，所述来源样品是具有显著量染色质存在的细胞培养收获物、组织样品或体液，并且使所述来源样品经受一个或多个用于澄清、纯化或分级分离的过程以获得用于本专利技术方法中的具有小于约5％的来源样品的染色质的制剂。具体实施方式关于本专利技术的某些方面，已发现通过下述方式可以实现在含有IgG抗体的制剂的纯化水平方面的惊人改进：进行针对染色质的澄清，之后采用具有足以保留抗体的孔隙度的带电膜进行分级分离过程。因此在某些方面，本专利技术的纯化方法针对含有IgG抗体的制剂，其中所述制剂已通过导致染色质水平相比于其原始来源显著降低的一个或多个过程而获得。例如，在某些实施方案中，提供期望的IgG抗体的原始来源样品是细胞培养收获物、体液或组织样品，并且使所述原始来源样品经受用于显著降低染色质水平的步骤；在某些此类实施方案中，原始来源样品的染色质水平降低超过95％，使得向本专利技术方法提供的所述制剂具有小于5％的最初存在于来源样品中的染色质。染色质降低的水平可以参考原始来源样品中以及本专利技术方法中提供的制剂中的水平来评估。染色质降低的水平可以参考组蛋白的水平和/或DNA的水平来评估。在某些实施方案中，所述制剂中的染色质水平相对于从中最终得到所述制剂的原始来源样品或介质中的染色质水平降低了至少96％、97％、98％、99％或99.9％。在其中采取多个步骤来制备所述制剂的某些实施方案中，染色质水平的降低的确定是针对在所有制备或纯化步骤之前的原始样品中的量而做出的，而不是与在即将获得所述制剂之前的倒数第二样品进行比较而做出的。在某些方面，本专利技术提供从含有IgG抗体和污染物的制剂纯化所述抗
体的方法。该方法包括使所述制剂与正电膜接触的步骤，所述正电膜具有下述孔隙度，所述孔隙度保留至少50％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所选大小的未被吸附的溶质通过，并且所选大小可以是约10nm到约15nm的任何量。在所述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得(1)当所述盐以小于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到所述制剂中的IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围；或(2)当所述盐以大于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到约9的范围。接触步骤的最终操作条件由以下来限定：所述制剂中不存在过量盐或所述制剂不大于20mM的非零盐浓度，以及在约5到IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围的pH值。在某些实施方案中，向所述方法提供的所述制剂为具有降低的染色质水平的形式，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从含有IgG抗体和污染物的制剂纯化所述IgG抗体的方法，其包括：提供以下形式的制剂，所述制剂含有小于5％的驻留在从中获得所述制剂的来源样品中的染色质，和使所述制剂与正电膜接触，所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少50％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过，其中所述所选大小选自约10nm到约15nm，进一步地，其中在所述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得(1)当所述盐以小于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到所述制剂中的所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围；或(2)当所述盐以大于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到约9的范围；并且其中所述接触步骤的最终操作条件由以下来限定：所述制剂中不存在过量盐或所述制剂不大于20mM的非零的盐浓度，以及在约5到所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围的pH值。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.19 US 61/941,9111.一种从含有IgG抗体和污染物的制剂纯化所述IgG抗体的方法，其包括：提供以下形式的制剂，所述制剂含有小于5％的驻留在从中获得所述制剂的来源样品中的染色质，和使所述制剂与正电膜接触，所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少50％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过，其中所述所选大小选自约10nm到约15nm，进一步地，其中在所述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得(1)当所述盐以小于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到所述制剂中的所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围；或(2)当所述盐以大于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到约9的范围；并且其中所述接触步骤的最终操作条件由以下来限定：所述制剂中不存在过量盐或所述制剂不大于20mM的非零的盐浓度，以及在约5到所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围的pH值。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约11nm。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约12nm。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约13nm。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约14nm。6.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少60％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。7.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少70％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。8.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少80％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。9.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少90％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。10.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少95％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。11.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少99％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。12.根据权利要求1-11所述的方法，其中在并非在应用最终操作条件时的所述接触步骤的一部分期间，所述制剂的条件的特征在于不存在盐或存在最高达饱和的非零浓度的盐。13.根据权利要求1-12所述的方法，其中所述盐选自由氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、溴化铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵和其组合组成的组。14.根据权利要求1-13所述的方法，其中所述方法包括：通过将所述制剂与驻留于所述来源样品中的至少95％染色质分离开而由所述来源样品获得所述制剂的步骤。15.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·斯坦利·加尼翁，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG