本发明专利技术公开了CARHER1-NKT细胞在制备用于治疗进展期HER1阳性胆管癌的制剂中的应用，其中，CARHER1-NKT细胞是由嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ包括串联的大鼠生长激素信号肽、HER1ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。采用本发明专利技术的CARHER1-NKT细胞治疗进展期HER1阳性胆管癌时，能够有效避免采用现有靶向HER1的药物时引起的耐药性，对胆管癌细胞具有一定的特异杀伤活性，且对进展期HER1阳性胆管癌患者有一定的治疗效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中CARHER1-NKT细胞在制备用于治疗进展期HER1阳性胆管癌的制剂中的应用。
技术介绍
EGFR(epithelial growth factor receptor，表皮生长因子受体)即HER1，是原癌基因c-erbB1的表达产物，属于人类表皮生长因子受体(HER)家族，其本身具有酪氨酶激酶活性，一旦与表皮生长因子(EGF)组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。HER1在多种恶性肿瘤中高表达，研究发现HER1在胆管癌组织中呈现过度激活的现象，其表达水平高达80％，且其表达水平与胆管癌疾病的进展及转移有关。尽管最近胆管癌的治疗已经获得一定的进展，但是仍然未提高患者的生存率，因此亟需探讨新的疗法来克服这一困扰。目前，在治疗进展期HER1阳性胆管癌患者时，抗HER1的药物(如靶向HER1的小分子抑制剂)已经处于临床研究阶段，但是，临床结果表明，仅部分胆管癌患者采用靶向HER1的小分子抑制剂治疗有效，并且患者最终会产生一定的耐药性，从而影响药物的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中采用抗HER1的药物治疗进展期HER1阳性胆管癌患者时引起的耐药性的缺陷，提供CARHER1-NKT细胞
在制备用于治疗进展期HER1阳性胆管癌的制剂中的应用，采用本专利技术的CARHER1-NKT细胞治疗进展期HER1阳性胆管癌时，能够有效避免采用现有抗HER1药物时引起的耐药性，对胆管癌细胞具有一定的特异靶向杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期HER1阳性胆管癌患者有一定的治疗效果。因此，为了实现上述目的，本专利技术提供了CARHER1-NKT细胞在制备用于治疗进展期HER1阳性胆管癌的制剂中的应用，所述CARHER1-NKT细胞是由嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，其中，所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ包括串联的大鼠生长激素信号肽、HER1ScFv、CD8的铰链区(hinge区)和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。在治疗进展期HER1阳性胆管癌时，本专利技术的CARHER1-NKT细胞能够特异性结合HER1抗原，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向识别胆管癌细胞表面HER1抗原的能力，加强对胆管癌细胞的特异杀伤活性，而且确实能够有效避免采用现有抗HER1的药物治疗时引起的耐药性，对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期HER1阳性胆管癌患者有一定的治疗效果。本专利技术的工程化HER1靶向性的NKT细胞(即CARHER1-NKT细胞)为治疗进展期HER1阳性胆管癌提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。图2为本专利技术的慢病毒表达载体pWPXL-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内
切酶MluI/NdeI双酶切片段的电泳鉴定图。图3为本专利技术的慢病毒表达载体pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶MluI/NdeI双酶切片段的电泳鉴定图。图4为本专利技术的慢病毒表达载体pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓缩液对NKT细胞的感染效率。图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(CARHER1-NKT细胞)表型鉴定的结果。图7为本专利技术的CARHER1-NKT细胞对人胆管癌细胞杀伤作用的细胞毒性分析图。图8为本专利技术的CARHER1-NKT细胞对进展期HER1阳性的胆管癌患者的治疗过程中，不同时间段患者的胆管病灶及转移淋巴结病灶变化图。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了CARHER1-NKT细胞在制备用于治疗进展期HER1阳性胆管癌的制剂中的应用，所述CARHER1-NKT细胞是由嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，其中，所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ包括串联的大鼠生长激素信号肽、HER1ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。本专利技术的应用中，优选情况下，所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ由大鼠生长激素信号肽、HER1ScFv、CD8的
铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。进一步优选地，嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，更进一步优选地，嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术的应用中，优选情况下，编码所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，编码嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。本专利技术的应用中，优选情况下，CARHER1-NKT细胞的制备方法包括：包装携带pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，其中，所述pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ为含有编码嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的基因的慢病毒表达载体。本专利技术的应用中，慢病毒表达载体pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137–CD3ζ能够与辅助载体共转染包装细胞如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及CARHER1-NKT细胞。对于慢病毒表达载体pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法包括以下步骤：(1)从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域，并克隆至载体pWPXL-GFP中，构建得到pWPXL-CD8-CD137-CD3ζ；(2)合成编码大鼠生长激素信号肽和HER1ScFv的核苷酸序列，并
克隆至pWPXL-CD8-CD137-CD3ζ中，经测序验证后得到序列正确的pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。步骤(1)中，对于从NKT本文档来自技高网...
【技术保护点】
CARHER1‑NKT细胞在制备用于治疗进展期HER1阳性胆管癌的制剂中的应用，其特征在于，所述CARHER1‑NKT细胞是由嵌合抗原受体HER1ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ修饰的NKT细胞，其中，所述嵌合抗原受体HER1ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ包括串联的大鼠生长激素信号肽、HER1ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。
【技术特征摘要】
1.CARHER1-NKT细胞在制备用于治疗进展期HER1阳性胆管癌的制剂中的应用，其特征在于，所述CARHER1-NKT细胞是由嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，其中，所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ包括串联的大鼠生长激素信号肽、HER1ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，优选地，所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其中，编码所述嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其中，所述CARHER1-NKT细胞的制备方法包括：包装携带pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，其中，所述pWPXL-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ为含有编码嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的基因的慢病毒表达载体。5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述CARHER1-NKT细胞的制备方法还包括通过如下方法制备NKT细胞：(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；优选地，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一NKT细胞培养液中，所述第...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩为东，丰恺超，郭业磊，王晓慧，王瑶，代汉仁，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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