结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术提供一种结合RT‑PCR与NEST‑PCR的草鱼出血病病毒检测试剂盒和检测方法。设计巢式PCR反应(NEST‑PCR)，以RT‑PCR反应产物作为模板，进行NEST‑PCR扩增，有效提高了检测的灵敏度，可检测到携带较低病毒拷贝数的样品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种草鱼出血病病毒检测试剂盒和检测方法，尤其涉及一种结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒(GCRV-GD108)检测试剂盒和检测方法，属于鱼类病毒检测

技术介绍
草鱼是我国重要养殖品种，但养殖过程极易发生病害，尤其是病毒性出血病可导致草鱼高发病率与死亡率。草鱼出血病成为制约草鱼养殖业发展的瓶颈。该病主要发生在鱼种阶段，是一种流行广、危害极大的传染性鱼病，病毒的感染可导致病鱼各器官组织出现不同程度的充血、出血，严重时死亡率可高达90％以上。1983年我国首次报道草鱼出血病的病原为草鱼出血病病毒(Grass carp haemorrhage，GCHV)。1995年国际病毒分类委员会将其命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp Reovirus,GCRV)，归属于呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属。GCRV是中国分离鉴定的第一株鱼类病毒，GCRV 873株为其代表株，也是中国在国际上完成全基因组序列分析的第一株水生呼肠孤病毒。近年，中国水产科学研究院珠江水产研究所从广东养殖草鱼患出血病病鱼体上分离到一株病毒株(GCRV-GD108株)，证实该毒株对草鱼具有强致病性，并成功克隆其全基因组，成为第二个获得全基因组序列的草鱼出血病病毒株。序列分析显示其隶属水生呼肠孤病毒属，但其分子特性显著有别于草鱼呼肠孤病毒GCRV-873等已知病毒株，并发现GCRV-GD108株在我国南方草鱼各主养区的病毒流行株中具有代表性(Xing Ye,Yuan-yuan Tian,Guo-cheng Deng,Yan-yan Chi,Xiao-yan Jiang.Complete genomic sequence of a reovirus isolated from grass carp in China.Virus Research,2012,163:275–283[1]；田园园，叶星，邓国成，黎炯，王杭军.南方养殖草鱼呼肠孤病毒的分子特性比较及双重PCR检测方法的建立.病毒学报，2011，27(4)：358-365[2]；Ye X,Tian Y.Advances in GCRV research:Virus molecular type and immunogen.SM Virol.2016,1(1):1003[3])。同时近年对南方多个草鱼主养区的随机抽样检测发现，草鱼苗种携带病毒的情况普遍存在，且多与GD108株相同。有些病鱼外表具有明显病症(如体表鳍条基部、腹部、口腔、肌肉等出血)，往往经过RT-PCR即可检测到病毒GD108株，但有些苗种外观及摄食活动正常的草鱼苗种也可能带有病毒、但由于病毒的数量较少而未能通过RT-PCR检测到，选购此类外表健康但实际上携带有病毒的草鱼苗种进行池塘养殖常常导致大批量的死亡，给养殖生产带来极大经济损失。因此提高草鱼出血病病毒GD108株的检测效率与灵敏度，对保障草鱼成鱼养殖的高存活率与养殖经济效益，真正从苗种供给源头上进行有效监控，并对选择使用特异性疫苗进行免疫、实现草鱼出血病的有效防控具有重要的意义。申请号为201310430466.0的中国专利技术专利公开了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法，可以实现在一个待测样本中同时检测草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的存在,并能对两种病毒的负载水平进行定量。但是该方法需要在提取病毒总RNA后进行独立的反转录反应，以获得cDNA第一链作为下一步PCR检测的模板；申请号为201210398483.6公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法，根据三种类型草鱼呼肠孤病毒的第二节段的共有序列设计引物，通过RT-PCR法检测样品或细胞中是否有草鱼呼肠孤病毒的感染，但此法无法区分是哪种类型的草鱼呼肠孤病毒。现有技术中尚未见针对GCRV-GD108株、提高其检测效率与灵敏度的检测方法的相关报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、针对性强的结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒(GCRV-GD108株)检测试剂盒，包括：(1)一步法RT-PCR反应混合液：25μL的反应体系中，包括One Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 12.5μL，引物对1的浓度为0.4μM，所述引物对1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)其中，One Step Enzyme Mix包括反转录酶、DNA聚合酶、Rnase抑制剂。2×1 Step Buffer包括：反应buffer、dNTP混合物(终浓度400uM)、One Step Enhancer Solution。(2)NEST-PCR反应混合液：20μL的反应体系中，包括PremixTaq Mix10μL，引物对2的浓度为0.4μM，所述引物对2具有SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列，具体地，引物对2的序列如下：正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4)其中，PremixTaq Mix包括：2倍浓度的DNA聚合酶、Buffer、dNTP混合物。本专利技术的另一目的是提供一种结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒(GCRV-GD108株)检测方法，具体包括以下步骤：(1)、RNA的获取：提取待测草鱼组织的总RNA，作为RT-PCR反应的模板；(2)、RT-PCR扩增：采用25μL的扩增体系，将反应混合液置于PCR仪进行RT-PCR扩增，所述反应混合液中，包括步骤(1)获取的RNA模板2μL，One Step Enzyme Mix 1μL，2×1 Step Buffer 12.5μL，引物对1的浓度为0.4μM，余量由DEPC处理水补足，放入PCR仪进行RT-PCR扩增，其中，所述引物对1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)(3)、检测RT-PCR扩增结果：取RT-PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片在349bp大小处有条带，则确定该样品携带草鱼出血病病毒GCRV-GD108株，若电泳图片在349bp大小处没有条带，则继续进行步骤(4)；(4)、NEST-PCR扩增：以电泳图片在349bp大小处没有条带的RT-PCR扩增产物作为模板，进行NEST-PCR扩增，采用20μL的扩增体系：DNA模板2μL，PremixTaq Mix 10μL，引物对2的浓度为0.4μM，其余由灭菌ddH2O补足，其中，所述引物对2具有SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列，具体地，引物对2的序列如下：正本文档来自技高网...

【技术保护点】
结合RT‑PCR与NEST‑PCR的草鱼出血病病毒检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)一步法RT‑PCR反应混合液：25μL的反应体系中，包括One Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 12.5μL，引物对1的浓度为0.4μM，所述引物对1具有SEQ ID NO：1‑2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)(2)NEST‑PCR反应混合液：20μL的反应体系中，包括Premix Taq Mix 10μL，引物对2的浓度为0.4μM，所述引物对2具有SEQ ID NO：3‑4所示的核苷酸序列，具体地，引物对2的序列如下：正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4) 。

【技术特征摘要】
1.结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)一步法RT-PCR反应混合液：25μL的反应体系中，包括One Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 12.5μL，引物对1的浓度为0.4μM，所述引物对1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)(2)NEST-PCR反应混合液：20μL的反应体系中，包括Premix Taq Mix 10μL，引物对2的浓度为0.4μM，所述引物对2具有SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列，具体地，引物对2的序列如下：正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4) 。2.一种结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、RNA的获取：提取待测草鱼组织的总RNA，作为RT-PCR反应的模板；(2)、RT-PCR扩增：采用25μL的扩增体系，将反应混合液置于PCR仪进行RT-PCR扩增，所述反应混合液中，包括步骤(1)获取的RNA模板2μL，1Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 12.5μL，引物对1的浓度为0.4μM，余量由DEPC处理水补足，放入PCR仪进行RT-PCR扩增，其中，所述引物对1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)(3)、检测RT-PCR扩增结果：取RT-PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于 凝胶成像系统中成像，电泳图片在349bp大小处有条带，则确定该样品携带草鱼出血病病毒GCRV-GD108株，若电泳图片在349bp大小处没有条带，则继续进行步骤(4)；(4)...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶星，董浚键，赵立祥，曾庆凯，孙成飞，田园园，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44