本申请公开了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，提取pgRNA后，使用RNase‑free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，采用qRT‑PCR的方法达到对pgRNA的定量检测，本申请还提供了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒。本申请，达到了如下效果：1)采用血液检测，无创，常规且可大规模应用；2)可检测血液中超低载量的PgRNA；4)该试剂盒及其在预测NA停药的应用可深入研究中国乙肝PgRNA形态，为开发PgRNA药物提供基础研究数据。给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志”的问题解决提供了方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
乙肝病毒颗粒在人体内的生命过程已经研究得很透彻：HBV的复制过程中存在逆转录的步骤，因此其生活周期不同于其它DNA病毒，由于逆转录酶的特性，HBV的突变率要高很多。HBV DNA在完整病毒中以松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)的形式存在，HBV病毒颗粒进入肝细胞后，脱去外面的衣壳，其rcDNA进入细胞核，形成共价闭合环状DNA(covalentlt closed circular DNA，cccDNA)，以cccDNA为模板，转录形成前基因组RNA(PgRNA)和其它mRNA，PgRNA在逆转录酶的作用下形成rcDNA，rcDNA与相关蛋白组装形成HBV病毒颗粒。一些临床试验的研究结果表明，之所以部分HBV DNA已经检测不到，结果呈现阴性的乙肝患者的病情仍在继续，其根本原因在于患者体内病毒颗粒的核心部件没有清除干净，也没有停止工作。其中，HBV cccDNA就是目前临床上较为公认的“核心部件”之一。但是，现有的拉米夫定(LAM)等NA抗病毒药物并不能完全清除HBV cccDNA，经过较长一段时间抗病毒治疗后的乙肝患者稳定感染的细胞中，细胞核内cccDNA仍旧维持在一定的水平，每个肝细胞内约有5-50个拷贝。但是，HBV cccDNA主要存在于肝脏细胞中，取材及检测都非常困难。嗜肝DNA病毒科中的乙型肝炎病毒(HBV)是经典的DNA逆转录病毒，其进入细胞后以DNA作为模板转录出四种转录体(RNA)，转录体中有一种称为前基因组RNA，也即是PgRNA。这种RNA上带有包装信号，能够被包装入核心颗粒。研究表明，仅有PgRNA能够被包装入核心颗粒，其它类型的转录体都不能被包装进入核心颗粒，这也就意味着HBV的DNA基因组仅能由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到，即DNA-RNA-DNA。鉴于PgRNA的在乙肝病毒颗粒复制过程中的重要性，它很可能成为新的NA停药指标。国内外，现在都没有获批的或科研型的成品商业化试剂盒，故，开发HBV PgRNA成品试剂盒具有一定的市场独家性和应用创新性。另外，在科学研究领域，国内对PgRNA的研究寥寥无几，国外对PgRNA的研究也多集中在与HBV DNA、HBsAg等直接相关性上，没有“PgRNA与抗病毒治疗停药后复发”的关系研究。现阶段，乙肝治疗的目标是最大限度的长期抑制HBV病毒颗粒的复制，减轻肝细胞炎性坏死及肝纤维化，达到延缓和减少肝功能衰竭、肝硬化失代偿、肝癌及其他并发症的发生，从而改善生活质量和延长生存时间。在乙肝治疗用药时，现在评估“何时停药”，也即是评估“治疗终点”的指标，除了常规生化指标HBeAg、HBsAg和ALT之外，写入临床指南的分子生物学指标就是HBV DNA，大致情况如下：1)HBV DNA：依据此指标判断“何时停药”，存在延长治疗的“过度治疗”和停药后复发反弹的“再治疗”问题。另外，临床指南也明确指出此停药指标存在的问题，并提出十大待解决问题之一：寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志。2)HBV cccDNA：检测HBV cccDNA的技术已不是问题，常见的有RT-PCR(实时聚合酶链式反应技术)和FISH(荧光原位杂交技术)。但是，国内外还没有CFDA/FDA批准的试剂盒应用，国内只存在少数科研型商品化试剂 盒。HBV cccDNA检测应用为何步履维艰、难以推广呢？主要原因有：①cccDNA主要存在于肝细胞中，在血液、组织液中HBV基因组以rcDNA形式存在。若要检测cccDNA，就必须以肝组织为标本。有创活检在绝大多数医院不是常规项目，而且肝组织标本检测cccDNA难度很大；②大量的实验结果表明都没能在外周血单个核细胞中检出cccDNA；③重症肝炎前期及重症期间的患者血清中都未能检出cccDNA；④总之，cccDNA在肝组织中存在的特殊性，导致cccDNA检测技术和应用难度都很大。3)尽管HBV PgRNA也主要存在于肝细胞中，但是，类似于临床ALT(丙谷转氨酶)、AST(谷草转氨酶)在肝细胞遭到破坏后会释放入血液一样，预测HBV PgRNA也会存在于血液中，并与疾病的严重程度相关。专利预实验结果也已充分证实了乙肝患者血液中存在HBV PgRNA的结论，只是血液中HBV PgRNA含量较低，其本身也较容易被RNase降解。所以，开发稳定、可靠、灵敏的HBV PgRNA定量检测方法是解决问题的技术关键所在，专利已完成相关技术难点的攻关。4)临床上常用的拉米夫定(LAM)等抗病毒药物抑制的是PgRNA逆转录，而cccDNA的含量又相对稳定，再加上“乙肝病毒DNA基因组仅能由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到”的特殊地位，血液中的HBV PgRNA含量可能是一个更好的评价患者病情的指标。5)临床上服用抗病毒药物的患者停药后1年内，约一半的患者表现出持续的病毒学应答，但是还有约50％的患者停药后很快就会复发反弹，专利预测这与患者体内“尽管HBV DNA低载量，但是HBV PgRNA高载量”的原因有关，HBV PgRNA可能成为预测NA停药的新指标。因此，采用高灵敏度、操作简单、检测时间短的RT-qPCR技术对抗病毒治疗的乙肝患者血液样本实施HBV PgRNA含量的定量测定，给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志” 的问题解决提供了新的思路与可能。HBV PgRNA：国内外，既没有获批的、科研型的HBV PgRNA成品商业化试剂盒，也没有PgRNA与“NA停药后复发”相关性上的研究。核苷(酸)类似物(NA)抗病毒治疗是抑制PgRNA的逆转录，最终结果是逐渐耗竭肝细胞内的cccDNA，而肝内cccDNA的含量又相对稳定(5-50个拷贝)，再加上近年来的实验研究和专利预实验已证实乙肝患者血液中PgRNA的存在性并可以检测到。故此“血HBV PgRNA定量检测试剂盒”具有市场独家性和应用创新性，有良好的经济前景和应用前景。
技术实现思路
本申请解决的主要问题是提供检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、试剂盒，以解决无法实现的技术问题。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血3-5ml注入无菌收集管，室温放置；HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBV RNA，获得HBV RNA粗品；HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase-free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，包括如下步骤：1)建立如下反应体系：RNase-Free DNase 10X反应缓冲液1ul；RNase-Free DNase1ul/ug；RNA无核酸酶的水补足至10ul；将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取1-8ul加入如下反应体系中；2)37℃孵育半小时；3)加入1ul终止液终止反应；4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；pgRNA的定量检测：使用qRT-PCR定量检测pgR本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血3‑5ml注入无菌收集管，室温放置；HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBV RNA，获得HBV RNA粗品；HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase‑free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，包括如下步骤：1)建立如下反应体系：RNase‑Free DNase 10X反应缓冲液1ul；RNase‑Free DNase1ul/ug；RNA无核酸酶的水补足至10ul；将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取1‑8ul加入如下反应体系中；2)37℃孵育半小时；3)加入1ul终止液终止反应；4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；pgRNA的定量检测：使用qRT‑PCR定量检测pgRNA，包括：如下步骤：1)配制qRT‑PCR反应体系，qRT‑PCR反应体系：PCR反应液12.5μL；引物探针混合液1.5ul；灭菌蒸馏水6μL；所述引物的上游引物包含如SEQ ID NO：3所示的碱基序列；下游引物包含如SEQ ID NO：6所示的碱基序列；所述探针，包含如SEQ ID NO：7所示的碱基序列；2)各反应管在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μL/管分装至PCR仪样品反应管中待用；3)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5μL加入相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽；4)将振荡均匀的反应管置于qPCR仪中，根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环条件，完成qRT‑PCR反应；结果分析及判定：采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。...
【技术特征摘要】
1.检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血3-5ml注入无菌收集管，室温放置；HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBV RNA，获得HBV RNA粗品；HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase-free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，包括如下步骤：1)建立如下反应体系：RNase-Free DNase 10X反应缓冲液1ul；RNase-Free DNase1ul/ug；RNA无核酸酶的水补足至10ul；将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取1-8ul加入如下反应体系中；2)37℃孵育半小时；3)加入1ul终止液终止反应；4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；pgRNA的定量检测：使用qRT-PCR定量检测pgRNA，包括：如下步骤：1)配制qRT-PCR反应体系，qRT-PCR反应体系：PCR反应液12.5μL；引物探针混合液1.5ul；灭菌蒸馏水6μL；所述引物的上游引物包含如SEQ ID NO：3所示的碱基序列；下游引物包含如SEQ ID NO：6所示的碱基序列；所述探针，包含如SEQ ID NO：7所示的碱基序列；2)各反应管在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μL/管分装至PCR仪样品反应管中待用；3)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5μL加入相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽；4)将振荡均匀的反应管置于qPCR仪中，根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环条件，完成qRT-PCR反应；结果分析及判定：采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。2.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：(1)预变性的条件，95℃3min；(2)变性的条件，94℃15sec×40个循环；(3)退火，延伸，荧光采集,60℃35sec×40个循环；(4)仪器冷却，25℃1min。3.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，其特征在于，所述HBV pgRNA的提取的步骤，包括：1)在样品反应管中加入10μL蛋白酶K、4μL助沉剂、3...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶锋，刘明坤，余荣，
申请(专利权)人：北京旌准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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