本发明专利技术属于工业微生物技术领域，涉及一种采用生物表面活性剂‑茶皂素强化培养生物破乳菌的方法。该方法主要包括以下步骤：发酵初始添加一定浓度范围的茶皂素；发酵结束后评价生物量及其破乳效能；优选能够同时显著实现破乳菌促产提效的茶皂素浓度。本发明专利技术中所采用的茶皂素具有高表面活性、生态友好性、低毒、价廉易得等特性，在较低的投加量下即可对破乳菌的生物量和破乳性能起到显著的促进作用，同时可降低破乳剂的合成成本，为破乳剂生产提供了一种简单有效的强化策略，从而为解决破乳剂应用中低产量、高成本这一瓶颈问题奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工业微生物
，涉及一种采用茶皂素强化培养生物破乳菌的方法。
技术介绍
在原油开采炼制、机械制造、食药加工等诸多行业的运营中会产生大量乳状液，不仅影响正常的工业生产，也对环境构成极大威胁，故需要对乳状液进行破乳便于其后续的处理及再利用。工业上常通过投加化学破乳剂来实现破乳。近年来，微生物破乳剂由于其具有能耐受酸碱、高盐度及高温等极端环境因素，对不同类型的乳状液适用性强，对环境不产生二次污染等特点，从而备受相关领域研究者的青睐。但低产量、高成本限制了其应用。破乳剂产生菌偏好利用低溶解度和可生物利用度的疏水性碳源是限制其生物量快速生长的一个主要因素。因此，疏水性碳源的强化利用是实现破乳剂合成促产和降本的重要途径。表面活性剂可强化疏水性有机化合物（HOCs）的生物利用，同时可改善微生物细胞的生物量及其表面疏水性。目前已有将表面活性剂应用于HOCs污染的生物修复，以强化HOCs去除的大量报道。Li等研究显示50 mg/L的SDBS可使菲的降解率提高8.9%，同时可使Citrobacter sp. SA01的生物量增加1.2倍，菌表疏水性增加25.2%。Zeng等采用38 mg/L的单鼠李糖脂可使十六烷的降解率提高15.6%，同时可使Candida tropicalis的生物量增加2.2倍，菌表疏水性得到显著增强。与生物修复中通常采用的化学表面活性剂（如Triton X-100、 Tweens、Brij和SDBS）相比，生物型表面活性剂（如茶皂素、鼠李糖脂）具有高表面活性、生态友好性、低毒或无毒的特性。其中，茶皂素较鼠李糖脂更为价廉易得。并且，Kaczorek等表明在柴油的生物降解中，茶皂素比鼠李糖脂和Triton X-100更有效。因而，茶皂素在HOCs的强化利用中具有明显的优势。纵观国内外相关领域的研究进展，目前利用茶皂素强化降解HOCs的研究局限在生物修复领域，申请人首次提出将茶皂素应用于以HOCs为碳源的生物制品-破乳菌的强化合成中。
技术实现思路
针对目前生物破乳菌产量低、成本高的问题，本专利技术目的在于提供一种采用茶皂素强化破乳菌生物量和破乳效能的方法，同时为表面活性剂在以HOCs为碳源的生物制品合成领域的应用提供一条新途径。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提出的采用茶皂素强化培养生物破乳菌的方法，具体步骤如下：（1）制备破乳菌种子液：将破乳菌菌种在营养琼脂平板上活化后接种至100mL肉汤培养基富集培养72 h，再将10mL富集液接入以4mL石蜡为碳源的100 mL改良矿物盐培养基中培养7d，得到破乳菌种子液；所述肉汤培养基为牛肉膏0.5g，鱼粉蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，pH =7.0；（2）制备发酵培养基：在含有4mL菜籽油的100mL改良矿物盐培养基中，添加0.01-0.05g茶皂素，得到发酵培养基；（3）在步骤（2）所得的发酵培养基中接入10mL步骤（1）得到的破乳菌种子液，30℃、130 rpm下培养7 d，得到菌株的全发酵培养液；（4）培养结束后，采用重量法来评价破乳菌生物量的促产效果；将菌株的全发酵培养液在12000rpm，4℃下离心10 min；弃去水相和残余油相，所得的细胞经正己烷反复洗涤至菌表无油吸附，之后-50℃下冷冻干燥24 h得到菌体干粉，称重；（5）采用模型乳状液破乳的瓶试法和Turbiscan Lab分析法来评价破乳菌破乳效能的促进效果，所述评价破乳菌破乳效能通过测菌体的破乳率、破乳速率和脱水质量得到；模型乳状液破乳的瓶试法如下：用煤油和水配制油包水型（W/O）模型乳状液，在250 mL高脚烧杯中，加入80 mL溶有1.526 g Span80和0.074 g Tween80的煤油溶液，然后加入120 mL蒸馏水，用高速搅拌乳化机10000 rpm下搅拌3.5 min；模型乳状液空白的24 h破乳率低于10%；乳状液的破乳率根据以下公式计算得到。本专利技术中，所述的破乳菌种子液中选用的破乳菌为产碱杆菌、诺卡氏菌、棒状杆菌、红球菌或微球菌中任一种。本专利技术中，步骤（1）和步骤（2）中所述改良矿物盐培养基（MMSM）为（L-1）：NH4NO34.0 g，K2HPO4 4.0 g，KH2PO4 6.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.001 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，EDTA 0.0014 g，pH值为9.0。本专利技术中，在步骤（２）中4mL菜籽油的100mL改良矿物盐培养基中，添加0.05 g茶皂素，得到发酵培养基。本专利技术中，所述的茶皂素投加剂量的优选，以同时显著实现破乳菌的促产提效为目标。本专利技术采用的茶皂素来源于茶树籽的提取物。本专利技术具有以下优点和有益效果：1.所采用的茶皂素为植物提取物，具有高表面活性、生态友好性、低毒或无毒的特性。2.0.05%（W/V）茶皂素投加量可使破乳菌的生物量较不投加茶皂素的对照组提高2.4倍。3.0.05%（W/V）茶皂素投加量可使破乳菌的破乳率较不投加茶皂素的对照组提高18%，并且破乳速率提升，脱水质量得到改善。4.茶皂素价格低廉，来源广泛，采用茶皂素强化破乳菌合成的手段简单高效，成本较低，适合于破乳菌发酵培养中的规模化应用。附图说明图1为在实施例1~-3及对比实施例中，不同浓度茶皂素添加培养所得破乳菌S-XJ-1的生物量和24 h破乳率；图2为在实施例1~-3及对比实施例中，不同浓度茶皂素添加培养所得菌破乳脱水过程中的动力学稳定性特征；图3为在实施例1~-3及对比实施例中，不同浓度茶皂素添加培养所得菌破乳脱水过程中的背散射光光强变化曲线。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术采用的茶皂素来源于茶树籽的提取物，为本专利技术原料之一。本专利技术采用的破乳菌为高效破乳剂产生菌产碱杆菌Alcaligenes sp. S-XJ-1。该菌筛自克拉玛依油田受石油污染的土壤，保存于−80℃的25%甘油管中。将保藏菌种在营养琼脂平板上活化后接种至100mL肉汤培养基（牛肉膏 0.5g，鱼粉蛋白胨 1 g，NaCl 0.5 g，pH =7.0）富集培养72 h，再将10mL富集液接入以4mL石蜡为唯一碳源的100 mL改良矿物盐培养基（MMSM）中培养7d得到种子液，为本专利技术原料之二。本专利技术培养破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1采用的MMSM为（L-1）：NH4NO3 4.0 g，K2HPO4 4.0 g，KH2PO4 6.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.001 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，EDTA 0.0014 g，pH=9.0。在含有4mL菜籽油的MMSM中，添加不同浓度的茶皂素（质量浓度分别为0.01%、0.03%和0.05%）得到发酵培养基，为本专利技术原料之三。本专利技术采用重量法来评价破乳菌生物量的促产效果。将菌株的全发酵培养液在12000rpm，4℃下离心10 min，弃去水相和残余油相，所得的细胞经正己烷反复洗涤至菌表无油吸附，之后-50℃下冷冻干燥24 h得到菌体干粉，称重。本专利技术采用模型乳状液破乳的瓶试法和Turbiscan Lab分析法来评价破乳菌破乳效能的促进效果。模型乳状液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用茶皂素强化培养生物破乳菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）制备破乳菌种子液：将破乳菌菌种在营养琼脂平板上活化后接种至100mL肉汤培养基富集培养72 h，再将10mL富集液接入以4mL石蜡为碳源的100 mL改良矿物盐培养基中培养7d，得到破乳菌种子液；所述肉汤培养基为牛肉膏0.5g，鱼粉蛋白胨1 g，NaCl0.5 g，pH =7.0；（2）制备发酵培养基：在含有4mL菜籽油的100mL改良矿物盐培养基中，添加0.01‑0.05 g的茶皂素，得到发酵培养基；（3）在步骤（2）所得的发酵培养基中接入10mL步骤（1）得到的破乳菌种子液，30℃、130 rpm下培养7 d，得到菌株的全发酵培养液；（4）培养结束后，采用重量法来评价破乳菌生物量的促产效果；将菌株的全发酵培养液在12000rpm，4℃下离心10 min；弃去水相和残余油相，所得的细胞经正己烷反复洗涤至菌表无油吸附，之后‑50℃下冷冻干燥24 h得到菌体干粉，称重；（5）采用模型乳状液破乳的瓶试法和Turbiscan Lab分析法来评价破乳菌破乳效能的促进效果，所述评价破乳菌破乳效能通过测菌体的破乳率、破乳速率和脱水质量得到；模型乳状液破乳的瓶试法如下：用煤油和水配制油包水型（W/O）模型乳状液，在250 mL高脚烧杯中，加入80 mL溶有1.526 g Span80和0.074 g Tween80的煤油溶液，然后加入120 mL蒸馏水，用高速搅拌乳化机10000 rpm下搅拌3.5 min；模型乳状液空白的24 h破乳率低于10%；乳状液的破乳率根据以下公式计算得到；。...
【技术特征摘要】
1.一种采用茶皂素强化培养生物破乳菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）制备破乳菌种子液：将破乳菌菌种在营养琼脂平板上活化后接种至100mL肉汤培养基富集培养72 h，再将10mL富集液接入以4mL石蜡为碳源的100 mL改良矿物盐培养基中培养7d，得到破乳菌种子液；所述肉汤培养基为牛肉膏0.5g，鱼粉蛋白胨1 g，NaCl0.5 g，pH =7.0；（2）制备发酵培养基：在含有4mL菜籽油的100mL改良矿物盐培养基中，添加0.01-0.05 g的茶皂素，得到发酵培养基；（3）在步骤（2）所得的发酵培养基中接入10mL步骤（1）得到的破乳菌种子液，30℃、130 rpm下培养7 d，得到菌株的全发酵培养液；（4）培养结束后，采用重量法来评价破乳菌生物量的促产效果；将菌株的全发酵培养液在12000rpm，4℃下离心10 min；弃去水相和残余油相，所得的细胞经正己烷反复洗涤至菌表无油吸附，之后-50℃下冷冻干燥24 h得到菌体干粉，称重；（5）采用模型乳状液破乳的瓶试法和Turbiscan Lab分析法来评价破乳菌破乳效能的促进效果，所述评价破乳菌破乳效能通过测菌体的破...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄翔峰，彭开铭，张宇燕，魏岩松，陆丽君，刘佳，娜雅，殷万，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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