本发明专利技术公开了一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法，所述5种黄酮类化合物为7‑羟基二氢黄酮、5,7‑二羟基‑4’‑甲氧黄酮醇、5,7‑二羟基双氢黄酮、2’,4’‑二羟基‑查尔酮和2’,4’‑二羟基二氢查尔酮，该方法是高速逆流色谱法。本发明专利技术以镰形棘豆为原料，所得产品纯度均大于99％，制备量大，产品纯度高，适合于工业应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天然药物领域，具体涉及从镰形棘豆中分离制备7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7–二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮和2’,4’-二羟基二氢查尔酮的方法。
技术介绍
黄酮类化合物是两个苯环通过中央三碳相互联接而成的一系列化合物。母体结构包括包括黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类以及查尔酮类等。藏药镰形棘豆(Oxytropis falcate Bunge)(藏药名为莪达夏)是豆科(Leguminosae)棘豆属(Oxytropis D.C.)多年生草本植物。生长在2700～4300m的河滩、沙地、山坡、草甸，主要产于青藏高原。据《晶珠本草》记载，镰形棘豆具有愈合疮口、利便、防止骨刺产生、治病痛、除毒、止血之功效，并能清毒、治疗炭疽病、麻风病及流感、扁桃体炎。临床研究证明，镰形棘豆对于预防、治疗流行性感冒及慢性气管炎有独特疗效。并且，药理实验证明镰形棘豆总黄酮苷元是治疗慢性气管炎的有效部分，并能增加肾上腺皮质功能，说明黄酮类化合物是镰形棘豆的重要活性成分。众所周知，由于植物中化合物种类众多且含量不一，从植物中直接大量获得有实用价值的高纯度化合物是极为困难的，尤其当需要从中同时提取出多个目标化合物时，则更为艰难。因此目前，尽管已知镰形棘豆中包含多种黄酮类化合物，却并没有以其为原料，同时得到多种高纯度活性化合物的报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述5种黄酮类化合物为7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7–二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮和2’,4’-二羟基二氢查尔酮，包括以下步骤：利用高速逆流色谱法分离制备5种黄酮类化合物：(a)取镰形棘豆提取物，溶于进样溶剂中，制备得到进样溶液；(b)将进样溶液注入高速逆流色谱仪，检测收集所述5种黄酮类化合物的流分，除去溶剂，即得7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7–二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮和2’,4’-二羟基二氢查尔酮。所述高速逆流色谱法的固定相为两相溶剂体系的上相，流动相为两相溶剂体系的下相；所述两相溶剂体系由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝10:4:10:10(v/v)组成。进一步地，所述进样溶剂是由所述上相和下相按照1:1的体积比组成的溶剂；所述进样溶剂与提取物的体积质量比为1:1～1:30mL/mg。进一步地，所述高速逆流色谱仪中分离管的转速为700-900rpm。进一步地，所述流动相的流速为1.5-4mL/min，进一步地，所述检测的波长为210-400nm。进一步地，所述检测的波长为280nm。进一步地，所述步骤(a)的镰形棘豆提取物中，其含有不低于8％w/w的7-羟基二氢黄酮，不低于7.5％w/w的5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇，不低于11％w/w的5,7–二羟基双氢黄酮，不低于19％w/w的2’,4’-二羟基-查尔酮和不低于13％w/w的2’,4’-二羟基二氢查尔酮。进一步地，所述提取物由下述方法制备得到：(1)取镰形棘豆，5-95％的乙醇提取，合并提取液，回收乙醇得到镰形棘豆乙醇粗提物；(2)将步骤(1)中的乙醇粗提物加水溶解，依次用石油醚和乙酸乙酯洗涤水相，将洗涤后的水相上大孔吸附树脂，依次用水、20～80％的乙醇作为洗脱液梯度洗脱，收集80％的乙醇洗脱液，回收乙醇即得。进一步地，所述步骤(1)中采用75％的乙醇提取。进一步地，所述步骤(2)中的梯度洗脱是依次用水、20％的乙醇、40％的乙醇、60％的乙醇、80％的乙醇作为洗脱液梯度洗脱，洗脱体积为2～50倍柱床体积。本专利技术以镰形棘豆为原料，分离制备得到了7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7-二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮和2’,4’-二羟基二氢查尔酮，产品纯度均大于99％。该方法制备量大，产品纯度高，适合于工业应用。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1为本专利技术镰形棘豆提取物的高效液相色谱图。图2为本专利技术镰形棘豆提取物的高速逆流色谱图。图3-7依次为化合物A～E的高效液相色谱图。具体实施方式仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)；prime泵及紫外检测系统(美国GE公司)；HX-1050恒温循环器(北京博医康实验仪器有限公司)；N2000色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)；Agilent 1200 HPLC仪，EclipseXDB-C18(5μm，4.6*150mm)，G1315B紫外-可见检测器(美国安捷伦科技有限公司)。DL.IO00E智能超声波清洗器(昆山仪器有限公司)；AM600核磁共振仪(瑞士Broker公司)。试剂：乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙酸乙酯和正己烷均为分析纯，HPLC分析用甲醇为色谱纯(山东禹王公司)；实验用水为超纯水；D101大孔树脂(南开大学化工厂)。实施例1 本专利技术方法1.本专利技术镰形棘豆提取物的制备取干燥的镰形棘豆全草500g，切碎至0.5～1.0cm碎段，加10倍体积的75％乙醇，于80℃回流提取3次，每次2h，合并提取液并减压浓缩至无醇味，得浸膏180g。将浸膏加水悬浮后，置于分液漏斗中，用石油醚(沸点60～90℃)进行萃取，直至石油醚萃取溶液无色。取水相，再用乙酸乙酯萃取，反复多次，直至乙酸乙酯萃取部无颜色。萃取后剩余水溶性部位上D101大孔树脂柱，依次用纯水、20％的乙醇、40％的乙醇、60％的乙醇、80％的乙醇洗脱，洗脱体积为柱床体积的20倍，每三个柱体积洗脱液相合并，将80％的乙醇洗脱部分浓缩至干，得浸膏20g，即得镰形棘豆提取物。2.高速逆流色谱分离纯化镰形棘豆提取物中的5种黄酮类化合物按照正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝10:4:10:10的体积比配制溶剂洗脱于分液漏斗中，充分摇动后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，以上相为固定相，下相为流动相。取200mg步骤1中制得的镰形棘豆提取物，溶于10mL上下相混合液(上下相的体积比为1:1)中，制备得到进样溶液。HPLC分析条件如下：色谱柱：C18(5μm,4.6*250mm)；流动相A:甲醇，B:水；梯度程序：0～5min,60％～65％甲醇；5～35min,65％～75％甲醇；流速1ml/min；柱温20摄氏度；检测波长280nm；进样量为10ul。此条件样品的HPLC色谱图如图1所示。用最大流速(30ml/min)将溶剂系统上相泵入主机并充满分离螺线管，开启循环水浴并将温度设定为25℃。开启主机电源以900r/min正向旋转，待转速稳定后，泵入流动相，待流动相从管柱出口流出且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处流出液在360nm波长下连续检测。高速逆流色谱图如图2所示，根据该色谱图手动收集流分A～E。结果显示，本专利技术方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述5种黄酮类化合物为7‑羟基二氢黄酮、5,7‑二羟基‑4’‑甲氧黄酮醇、5,7–二羟基双氢黄酮、2’,4’‑二羟基‑查尔酮和2’,4’‑二羟基二氢查尔酮，包括以下步骤：利用高速逆流色谱法分离制备5种黄酮类化合物：(a)取镰形棘豆提取物，溶于进样溶剂中，制备得到进样溶液；(b)将进样溶液注入高速逆流色谱仪，检测收集所述5种黄酮类化合物的流分，除去溶剂，即得7‑羟基二氢黄酮、5,7‑二羟基‑4’‑甲氧黄酮醇、5,7‑二羟基双氢黄酮、2’,4’‑二羟基‑查尔酮和2’,4’‑二羟基二氢查尔酮所述高速逆流色谱法的固定相为两相溶剂体系的上相，流动相为两相溶剂体系的下相；所述两相溶剂体系由正己烷‑乙酸乙酯‑甲醇‑水＝10:4:10:10(v/v)组成。
【技术特征摘要】
1.一种从镰形棘豆中分离制备5种黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述5种黄酮类化合物为7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7–二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮和2’,4’-二羟基二氢查尔酮，包括以下步骤：利用高速逆流色谱法分离制备5种黄酮类化合物：(a)取镰形棘豆提取物，溶于进样溶剂中，制备得到进样溶液；(b)将进样溶液注入高速逆流色谱仪，检测收集所述5种黄酮类化合物的流分，除去溶剂，即得7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7-二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮和2’,4’-二羟基二氢查尔酮所述高速逆流色谱法的固定相为两相溶剂体系的上相，流动相为两相溶剂体系的下相；所述两相溶剂体系由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝10:4:10:10(v/v)组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述进样溶剂是由所述上相和下相按照1:1的体积比组成的溶剂；所述进样溶剂与提取物的体积质量比为1:1～1:30mL/mg。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述高速逆流色谱仪中分离管的转速为700-900rpm。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述流动相的流速为1.5-4mL/min。5.根据权利要求1或2...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晨，李玉林，陈涛，刘永玲，李红梅，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海;63
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