用于定量检测钙卫蛋白的试纸条及其制备方法和钙卫蛋白浓度的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种用于定量检测钙卫蛋白的试纸条及其制备方法和钙卫蛋白浓度的测定方法，属于生物技术领域；所述的试纸条包括底板，所述的底板上附着有依次排列的样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫。本发明专利技术的试纸条具有检测结果准确，方便，成本低廉的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于定量检测人钙卫蛋白(钙卫蛋白)的免疫层析试纸条及其制备方法和钙卫蛋白(钙卫蛋白)浓度的即时快速测定方法。
技术介绍
钙卫蛋白(Calprotectin)是分子量为36kD的钙、锌结合蛋白。由两条分子量为14kD的重链和一条分子量为8kD的轻链以共价键连接的钙结合蛋白质异三聚体组成。钙卫蛋白被认为是多种疾病中可靠的炎症指标，它可以清楚的区分器质性疾病如炎症性疾病IBD和功能性疾病如IBS。这种体外诊断工具可以避免昂贵的费用和结肠镜侵入性的检查。2005年3月14-17日在伯明翰召开的英国肠胃病学学会(BSG)年会，专题讨论了炎症性肠病(IBD)-钙卫蛋白-肠激惹综合征(IBS)，将钙卫蛋白作为一个新的有用的诊断参考标志，用于：区别炎性肠病和肠激惹综合征；评估炎性肠病炎性活动性；评估炎性肠病黏膜治愈情况。粪便的钙卫蛋白的检测是一种简单、迅速的、灵敏度高、特异性强、廉价的、非侵袭性的炎性肠病检测方法。这种检测方法可以在正常人的黏膜和患病患者的炎性黏膜中都可获得准确的检测结果。受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析表明每150ug/g的截断点就可以区别炎性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)和肠应激综合征(irritablebowelsyndrome,IBS)患者,它的敏感性为100％,特异性达到了97％。对于钙卫蛋白的检测，目前临床的方法包括：酶联免疫法(ELISA)、胶体金法等方法，但这些方法都有各自的特点及不足。ELISA法由于定量准确，广泛应用于医院检验科，但检测时间长，不便捷；胶体金法虽然方便、快捷，但是是一种定性方法，其灵敏度较低；胶体金颗粒与抗体连接方式属于静电吸附，检测过程中脱落可造成结果不准确、不稳定。因此，临床上迫切需求建立一种快速、便捷、经济的钙卫蛋白定量检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供一种用于定量检测钙卫蛋白的免疫层析试纸条，其具有成本低廉，测定便捷的优点。本专利技术还提供了一种用于定量检测钙卫蛋白的免疫层析试纸条的制备方法。本专利技术还提供了一种用于定量检测钙卫蛋白的免疫层析试纸条的应用。一方面，本专利技术提供一种用于定量检测钙卫蛋白的试纸条，所述的试纸条包括底板，所述的底板上附着有沿纵向依次排列的样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫。进一步的，所述的样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫在所述的底板上从左到右依次排列，所述的样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫的长度比为13-17:10-12:20-24:24-24。进一步的，所述的标记抗体垫包括包被有标记物的第一钙卫蛋白单克隆抗体。进一步的，所述的标记物标记的第一钙卫蛋白单克隆抗体是荧光标记的钙卫蛋白抗体。进一步的，所述的包被膜上包被有检测带和质控带，所述检测带固定有第二钙卫蛋白单克隆抗体，所述的质控线上固定有兔抗鼠IgG抗体。进一步的，所述的包被膜为硝酸纤维素膜。另一方面，本专利技术提供一种用于定量检测钙卫蛋白的试纸条的制备方法，包括如下步骤：在试纸条的底板上依次固定样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫。进一步的，所述的包被膜通过如下方法制备而得：使用第一磷酸盐缓冲液分别稀释兔抗小鼠IgG和钙卫蛋白抗体得到兔抗小鼠IgG溶液和钙卫蛋白抗体溶液，所述的第一磷酸盐缓冲液浓度为0.01-0.03M，pH值为7.2-7.6，所述的兔抗小鼠IgG溶液和钙卫蛋白抗体溶液的浓度均为1mg/ml-1.5mg/ml；使用定量喷膜仪以0.8-1.2μl/cm的量将二者以0.5cm-1.0cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，35-38℃烘干0.5-1.5h，加入干燥剂封存备用。进一步的，所述的标记抗体垫由如下方法制备而得：制备钙卫蛋白抗体溶液：用第一硼酸盐缓冲液将钙卫蛋白抗体透析得到钙卫蛋白抗体溶液，所述的第一硼酸盐缓冲液浓度为0.03-0.07M，pH值为8.0-8.5，透析温度为3-5℃，透析时间T≥16h；将所述的钙卫蛋白抗体溶液浓度调整为1.5-2mg/ml；荧光微球预处理：使用pH4.5-5.0的MES活化缓冲液洗涤荧光微球，加入碳二亚胺和琥珀酰亚胺使二者终浓度均为18-22mmol/L，室温反应10-20min，充分洗涤荧光微球；用浓度为0.03-0.07M的pH值为8.0-8.5的第二硼酸盐缓冲液将预处理过的所述的荧光微球复溶后加入所述钙卫蛋白抗体溶液中，使所述的钙卫蛋白抗体与荧光微球的质量比为1-4∶50，室温反应1.5-2.5h，加入第二磷酸盐缓冲液室温封闭20-40min，所述的第二磷酸盐缓冲液中BSA的质量分数为10％，所述的第二磷酸盐缓冲溶液浓度为0.02M，pH值为7.2-7.6；用第三磷酸盐缓冲液保存液复溶至反应前体积，所述的第三磷酸盐缓冲液中按质量百分数计包括0.3-0.7％的BSA和0.2-0.3％的Tween-20，所述的第三磷酸盐缓冲液pH值为7.2-7.6，浓度为0.01-0.03M；使用定量喷膜仪以3-5μl/cm喷涂于玻璃纤维垫上，避光35-38℃烘干1h，加入干燥剂封存备用。再一方面，本专利技术还提供一种钙卫蛋白浓度的测定方法，包括如下步骤：标准曲线的绘制：将钙卫蛋白标准品配制成梯度浓度标准溶液进行荧光强度测定，以检测线、质控线的荧光强度比值为纵坐标，钙卫蛋白标准溶液浓度为横坐标，拟合成标准曲线。样品的检测：将待测样品滴到试纸条上，然后用荧光检测装置检测，得出所述的样品中的钙卫蛋白的浓度；所述的试纸条为权利要求1-6任一项所述的试纸条。使用时，在样品垫上加入样品液，在毛细作用下，样品液向吸水垫一端泳动，当待测标本中含有钙卫蛋白(钙卫蛋白)时，钙卫蛋白与荧光微球上的抗体结合形成复合物，随着层析作用，复合物向前移动到达检测线T处，复合物中的钙卫蛋白和包被膜上的钙卫蛋白抗体结合聚集在T线处，未结合的荧光微球标记物会继续前行，到达质控线C时，兔抗小鼠IgG抗体与荧光微球上的鼠源性单抗结合，在C线处出现荧光微球的聚集。整个反应在15分钟内完成，并进行上机读卡，T线和C线都会产生相应的荧光信号，荧光检测仪会根据定标卡上的信息将实际检测值代入预设的标准曲线中算出定量的结果。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下优点：本专利技术将钙卫蛋白单克隆抗体共价偶联在荧光微球上，喷于玻璃纤维垫上后作为检测的流动相，将兔抗小鼠IgG和另一种钙卫蛋白单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上作为捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于定量检测钙卫蛋白的试纸条，其特征在于，所述的试纸条包括底板，所述的底板上附着有沿纵向依次排列的样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫。

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测钙卫蛋白的试纸条，其特征在于，所述的试纸条包括底板，所述的
底板上附着有沿纵向依次排列的样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫。
2.根据权利要求1所述的用于定量检测钙卫蛋白的试纸条，其特征在于，所述的样品吸
收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫在所述的底板上从左到右依次排列，所述的样品吸收
垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫的长度比为13-17:10-12:20-24:24-24。
3.根据权利要求1所述的所述的用于定量检测钙卫蛋白的试纸条，其特征在于，所述的
标记抗体垫包括包被有标记物的第一钙卫蛋白单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的所述的用于定量检测钙卫蛋白的试纸条，其特征在于，所述的
标记物标记的第一钙卫蛋白单克隆抗体是荧光标记或胶体金标记的钙卫蛋白抗体。
5.根据权利要求1所述的所述的用于定量检测钙卫蛋白的试纸条，其特征在于，所述的
包被膜上包被有检测带和质控带，所述检测带固定有第二钙卫蛋白单克隆抗体，所述的质
控线上固定有兔抗鼠IgG抗体。
6.根据权利要求1所述的用于定量检测钙卫蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述
的包被膜为硝酸纤维素膜。
7.一种权利要求1-6任意一项所述的用于定量检测钙卫蛋白的试纸条的制备方法，其
特征在于，在试纸条的底板上依次固定样品吸收垫、标记抗体垫、包被膜和吸水垫。
8.根据权利要求7所述的用于定量检测钙卫蛋白的试纸条的制备方法，其特征在于，所
述的包被膜通过如下方法制备而得：
使用第一磷酸盐缓冲液分别稀释兔抗小鼠IgG和钙卫蛋白抗体得到兔抗小鼠IgG溶液
和钙卫蛋白抗体溶液，所述的第一磷酸盐缓冲液浓度为0.01-0.03M，pH值为7.2-7.6，所述
的兔抗小鼠IgG溶液和钙卫蛋白抗体溶液的浓度均为1mg/ml-1.5mg/ml；使用定量喷膜仪以
0.8-1.2μl/cm的量将二者以0.5cm-1.0cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，35-38℃烘干0.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：付国亮，段学军，
申请(专利权)人：付国亮，
类型：发明
国别省市：北京;11