角毛藻半定量检测试纸条及其制备使用方法技术

本发明专利技术描述了一种基于胶体金免疫层析分析技术（ｇｏｌｄ　　ｉｍｍｕｎｏ　　ｃｈｒｏｍａｔｏ　　ｇｒａｐｈｙ　　ａｓｓａｙ，ＧＩＣＡ）的半定量检测角毛藻试纸条。包括塑料载体板、硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜。检测试纸条硝酸纤维层、玻璃纤维层分别用胶固定在塑料载体板上；检测试纸条硝酸纤维膜上设有角毛藻抗原分级标记线、质控线；吸水玻璃纤维素膜层置于硝酸纤维膜检测层右端上方；该载体中部设有硝酸纤维膜检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有胶体金标记的兔抗角毛藻抗体的玻璃纤维素膜抗体标记层。本发明专利技术为常规环境监测、渔业养殖水体检测、以及赤潮生效过程监测的现场实验，提供快速简便的对赤潮多发藻进行半定量的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基于胶体金免疫层析分析技术(gold immunochromato graphy assay，GICA)的浮游藻类半定量免疫层析检测分析
，特别涉及角毛藻的半定量免疫层析检测分析试纸条及其制备检测方法领域，其属于免疫学和浮游生物学交叉

技术介绍
浮游植物的分类、鉴定和定量一直是藻类学和生态学研究中最基础的课题之一。对生态动力学、赤潮发生机制与预警预报、海水养殖水域常规检测等都有着重要意义。对于常规环境监测、渔业养殖水体检测等应用领域来说，需要一种对主要赤潮藻进行现场半定量检测的方法。本
技术实现思路
主要涉及海洋浮游植物的检测技术和胶体金免疫层析分析技术两个
现有的检测方法主要有基于形态学特征的分析方法、基于细胞色素的检测方法、基于分子探针的检测技术，以及不同技术的交叉如流式细胞术和FLOWCAM技术等。这些技术极大地丰富了浮游植物观测技术，推动了相关研究的发展，各项技术均有着突出的优势也存在着难以克服的制约因素。现有的浮游藻类检测方法主要包括1、基于形态学特征的分析方法传统的基于形态学的光镜和电镜观测技术是浮游植物鉴定与定量的基础，至今仍有着不可动摇的地位，发挥着很重要的作用。但其存在着耗时长，需要富有经验的专家、专业仪器设备等限制性因素。FLOWCAM技术是形态学与流式细胞术的结合，利用计算机技术对捕获的照片进行识别分类。相对传统技术，这一技术加快了分析的速度，但是仍然存在需要专家干预，形态相似的种类无法区分的缺点。同时由于技术的限制，该技术获得的图像分辨率较差，更在一定程度上影响了识别的准确度。2、流式细胞术该技术通过逐个测量细胞的散射光、细胞自体荧光、染色荧光和免疫标记荧光等来检测其生理生化指标并对其分类、收集。现已成为环境微生物学中的十分有用的工具。该技术的限制主要是在环境变化的情况下，细胞的形态、大小及生理生化特性会发生显著变化，而这正是流式细胞术的检测基础，这将影响该技术对于各种类的正确区分。同时仪器成本较高，对工作环境要求严格，需要良好训练的专业技术人员等因素也限制了其应用。3、基于细胞色素的检测方法由于不同种属的浮游藻中含有不同的色素组成，或特征色素，基于细胞色素的检测方法就是藉由检测样品中各种色素的丰度(及特征色素)对不同的浮游植物类群加以区分和定量。依据对色素的检测方法不同而有化学分类学方法、现场荧光、遥感反演等不同的技术。这些技术均可迅速的获取结果，但由于藻类色素的相似性，这些技术仅能提供浮游植物几种类群的分类数据，难以提供精确到种属结果。化学分类法是以分类对象各类群中化学成分的特征为分类依据。可以在藻纲一级进行较好的分类，甚至于对于某些形态学上十分相近的种类在标志化合物上也有着差异，可以借助这一方法区分鉴定。但在属或种之间的分类还不能完全实现。现场荧光方法是在光源的激发下，检测藻类中色素发出的荧光，借助光谱的差异可以区分不同的浮游植物类群。这一方法可以迅速测定，并可以在水下等现场环境连续测定，但此方法只能将浮游植物根据其色素分为几个类群。利用卫星遥感数据，对海域叶绿素含量进行测量。这一方法可以迅速提供广大区域的数据，但往往只能反演叶绿素含量，估算浮游植物总量，难以进一步提供浮游植物的类群等信息。同时，由于环境因素的变化、不同的生长周期，浮游植物的色素含量会发生变化，基于细胞色素的各种方法的检测结果也会受到影响。对于常规环境监测、渔业养殖水体检测来说，需要一种对主要赤潮藻进行现场快速简易低成本的检测方法。在现有浮游植物检测方法中尚未有完全适用的方法。而临床检测中的GICA技术由于具有不需仪器，操作简单，检测快速，并且可以给出半定量的结果而成为满足这一领域需求的最佳选择。目前国际国内在应用免疫学方法检测浮游植物的研究，多以制备抗体和ELISA检测居多，未有采用GICA技术检测浮游植物的研究。与ELISA不同处是GICA反应时间大大缩短，不需要仪器设备，仅需要数十分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用(immunoconcentraiton)。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。本专利技术通过免疫学技术，以藻细胞或提取物免疫实验动物，制备浮游藻的多抗，利用抗体，建立GICA的免疫分析方法。不需仪器，操作简单，检测快速，并且可以给出半定量的结果。
技术实现思路
胶体金标记技术(Immunogold labeling technique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术；胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。根据胶体金的一些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫-生物学特性，使其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。本专利技术的内容是首先制备抗体金探针，以GICA(胶体金免疫层析技术)技术为基础，通过精确控制膜上捕捉配体的量，使用多条不同浓度的平行捕捉配体线的方法，以显色条带的数目，判断分析物的浓度区间，建立对角毛藻的半定量检测试纸条。本专利技术主要分为九个部分1、抗体金探针(胶体金标记的抗体)的制备。采用常用的胶体金(如抗坏血酸还原法、鞣酸—柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法)制备方法，优化胶体金标记实验条件，取得稳定高效的抗体金探针。透析纯化目标藻抗体。检验制备的胶体金的颗粒直径、均匀度等指标，选择稳定的方法制备20～30nm的胶体金，4℃保存。2、藻类半定量免疫层析分析技术的建立。以GICA技术为基础，通过精确控制膜上捕捉配体的量，使用多条不同浓度的平行捕捉配体线的方法，通过显色条带的数目，判断分析物的浓度区间，建立对目标藻的半定量GICA技术。3、免疫原的制备。将生长旺盛的角毛藻细胞培养溶液用终浓度为2％的甲醛固定过夜，10000r/min离心10min，收集藻细胞沉淀。藻细胞团块再用蒸馏水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通过离心收集藻细胞，离心条件均为，10000r/min，10min。将收集的藻细胞分装于1.5mlEppendorf管，甩去残余水分，-20℃保存备用。临用前取出，用灭菌的5ml PBS重新悬浮均匀。将藻细胞标准溶液通过超声波和冷热交替处理(-75℃，15min；100℃，5min，三次循环)后得到已知细胞密度的破碎藻细胞标准溶液。4、多克隆抗体的制备及纯化。将处理好的藻细胞用0.5mlPBS重悬，混匀，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，乳化程度尽量完全。家兔通过腹腔注射、肌肉注射和背部皮下多点注射的方式进行免疫。初次免疫剂量分别约为每只家兔1×106、2×106和4×106个细胞，通过耳缘本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种角毛藻半定量检测试纸条，包括塑料载体板，玻璃纤维膜样品层、玻璃纤维膜抗体标记层、硝酸纤维膜检测层、玻璃纤维膜吸水层，其特征在于：所述检测试纸条玻璃纤维膜样品层、玻璃纤维膜抗体标记层、硝酸纤维膜检测层、玻璃纤维膜吸水层顺式胶合固定在塑料载体板一侧；所述检测试纸条硝酸纤维膜检测层上设有角毛藻抗原分级检测线、二抗质控线；所述玻璃纤维膜吸水层胶合在硝酸纤维膜检测层右端之上；所述塑料载体板中部设有硝酸纤维膜检测层，在该检测层与玻璃纤维膜样品层交界处，设有载有胶体金标记的角毛藻抗体的玻璃纤维膜抗体标记层，该层一端置于玻璃纤维膜样品层下，并与塑料载体板胶合，另一端设置在硝酸纤维膜检测层之上，并与硝酸纤维膜检测层胶合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：米铁柱，孙静，甄毓，亓海刚，何闪英，赵丽媛，于志刚，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]