本发明专利技术涉及胸腺提取物，具体公开了一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法。其是由动物胸腺组织经匀浆、变性、冻融后，离心取上清，并经过不同截留分子量的超滤系统超滤，获得截留分子量为30KD～50KD的中分子量胸腺蛋白和截留分子量小于10KD的胸腺肽，此外，收集前述过程中的离心后沉淀与超滤中弃掉的残液，提取得到DNA。本发明专利技术通过对提取工艺进行优化，不仅提高了胸腺肽的提取效率及纯度，同时综合利用胸腺肽生产工艺中的废料，提取具有药用价值的中分子量胸腺蛋白及DNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胸腺提取物，具体地说，涉及一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量 胸腺蛋白和DNA的方法。
技术介绍
胸腺是人体重要的免疫器官，能分泌激素和产生多种细胞因子的器官。由胸腺产 生的多肽和蛋白质控制调节着免疫反应。因此，国内外对胸腺提取物的研究广受人们的关 注。20世纪60年代，White、Goldste in和其同事在此领域中进行了许多努力，他们首次从胸 腺粗提物中纯化得到胸腺素，并且证实了初生胸腺缺陷小鼠注射胸腺素后，死亡率下降，存 活率上升，并且恢复了细胞免疫功能如抗皮肤移植能力。近年来，从胸腺组织和血液中已经 分离了几十种具有胸腺激素样活性的因子，很多已经研发成药物，用于治疗各种疾病。 胸腺肽是从胸腺素组分5中分化出来的一组蛋白质和多肽激素，是动物免疫系统T 淋巴细胞成熟、分化和功能化的必需因子，作为药物是一种免疫调节剂，现行国家药品标准 胸腺肽注射剂规定的分子量小于10KD。胸腺肽可用于治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷 病、某些自身免疫性疾病、各种细胞免疫功能低下的疾病及肿瘤的辅助治疗。胸腺肽在我国 临床应用已有20多年的历史，我国胸腺肽制品的市场不断扩大，年销量增长率较快，其产品 的市场前景较好。目前，胸腺肽制剂多采用生物提取法来获得。胸腺肽的制备工艺已经较为成熟，一般包括组织细胞破碎、离心分离、超滤、浓缩 等过程。通常包括以下方法：（1)用匀浆器或胶体磨将新鲜的胸腺匀浆，反复冻融，以破碎细 胞；（2)适宜温度下酶解并去除细菌热源；（3)离心或过滤去除组织细胞壁等固体杂质；（4) 上清液分级过滤，最后经IOKD分子量超滤膜超滤收集滤过液即为胸腺肽溶液。在此常规胸 腺肽的提取分离过程中，最后截留的分子量IOKD以上的部分视为废料倒掉，这样不仅造成 了资源的浪费，同时还污染了环境。 目前胸腺提取物主要集中在小分子胸腺肽，分子量小于IOKD，而有研究发现，从动 物胸腺中提取的分子量小于60KD的中小分子胸腺蛋白复合物，能明显促进成纤细胞、内皮 细胞增殖，对胃溃疡有明显促进愈合作用。已上市药物欣洛维(胸腺蛋白口服液)就是从胸 腺组织中提取的具有较强生物活性的中分子蛋白物质(分子量30KD~50KD)，是一种新型的 消化道粘膜保护剂，可用于治疗胃、十二指肠溃疡，也可用于慢性胃炎、急性胃粘膜病变、口 腔溃疡及溃疡性结肠炎的治疗。另外，胸腺组织中细胞核含量比重大，脱氧核糖核酸(DNA) 含量较高，而DNA作为生物遗传物质的基础，具有多种生理功能，广泛用于医药、畜牧业、食 品等领域。因此，很有必要开发一种综合利用胸腺生产胸腺肽、中分子量胸腺蛋白、DNA的生 产工艺，这样不仅使原材料得到充分利用，节约了生产成本，增加了产值，同时也减少对环 境的污染。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种从胸腺组织中提取胸 腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法，综合利用胸腺生产胸腺肽、中分子量胸腺蛋白、DNA。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下： 本专利技术首先提供一种从胸腺组织中提取胸腺肽和中分子量胸腺蛋白的方法，由动 物胸腺组织经匀浆、变性、冻融后，离心取上清，并经过不同截留分子量的超滤系统超滤，获 得截留分子量为30KD~50KD的中分子量胸腺蛋白和截留分子量小于IOKD的胸腺肽。 所述方法在提取胸腺肽的同时，还提取了中分子量胸腺蛋白，更好的利用了胸腺 资源。具体地，所述方法包括如下步骤： (1)匀浆:取动物胸腺组织，摘除多余组织得到胸腺，清洗后倒入胶体磨中匀浆，得 匀浆液； ⑵变性:将匀浆液升温至80~90°C，保持10~30min，得变性液； (3)反复冻融； (4)离心:将变性液以3000~6000转/分离心10~30分钟，得到上清液和沉淀Cl; (5)澄清过滤:将步骤(4)所得上清液过滤，除去上清液中粒径大于0.45μπι的大颗 粒，分别收集过滤液及截留物C2; (6)-次超滤:将步骤(5)所得过滤液用截留分子量50KD的超滤系统超滤，压力不 超过0.1 MPa，收集透过液及截留液Ll; (7)二次超滤:将步骤(6)所得透过液用截留分子量30KD的超滤系统超滤，压力不 超过O.IMPa，收集透过液与截留液Α，所述截留液A即为分子量范围为30KD~50KD的水溶性 中分子量胸腺蛋白原料； (8)浓缩:取步骤(7)所得透过液进行浓缩，冷冻保存； (9)三次超滤:将步骤(8)冷冻保存的浓缩液融化解冻，冻解液用截留分子量IOKD 的超滤系统进行超滤，压力不超过O.IMPa，收集透过液A及截留液L2,所述透过液A即为胸腺 妝原料。 为了提高胸腺肽的提取效率及纯度，同时为了提高中分子量胸腺蛋白及DNA的提 取效率，本专利技术优化了提取工艺如下：所述步骤（1)具体为:取动物胸腺组织，除去脂肪、导管、外膜后得到胸腺，清洗后 控干水分，倒入胶体磨中，按1:0.2~3(w/w)的比例加入纯化水，勾衆1~3min，得勾衆液。 所述步骤(3)具体为将变性液反复冻融2~4次，冷冻温度为_10°C~_20°C，融化温 度10~35°C。反复冻融能更加充分的裂解细胞，提高胸腺蛋白和胸腺肽的提取效率。 所述步骤(8)取步骤(7)所得透过液浓缩1~10倍。 在此基础上，本专利技术还提供了一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白 和DNA的方法，按照前述方法获得胸腺肽和中分子量胸腺蛋，并收集前述方法中的离心后沉 淀与超滤过程中弃掉的残液，提取其中的DNA。 更为具体地，在前述方法的基础上，还包括如下步骤： (10)将Cl、C2、LI、L2混合，加入NaCl溶液和SDS溶液，混匀； (11 )50~60°C水浴加热，离心取上清液，弃去沉淀。 (12)上清液加入等体积氯仿，涡混，静置过夜； (13)取上清液，加入乙醇进行沉淀，4°C放置过夜； (14)离心收集白色沉淀； (15)加入酒精搅拌，对沉淀进行清洗，离心，对离心后沉淀减压干燥，即得DNA粗 品。 该方法综合利用了胸腺生产胸腺肽、中分子量胸腺蛋白及DNA。在生产胸腺肽的同 时，利用了胸腺肽生产工艺中的废料，提取具有药用价值的中分子量胸腺蛋白及DNA，对胸 腺原料实现了最大化的利用。为了提高DNA的提取效率，本专利技术优化了提取工艺如下： 所述步骤（10)将(：1丄2、1^1、1^混合，加入2~3倍体积的1.5~2.5111〇1/1恥(：1溶液 和0 · 05~0 · 15倍体积的15%~25% (wt % )SDS溶液，混匀。 所述步骤(11)的离心条件为4000转/min，离心40min。 所述步骤（13)具体为取上清液，边搅拌边加入1 . 5~2.5倍体积的-2 0 °C 9 5 % (vt % )乙醇，产生白色絮状沉淀，4°C放置过夜； 取上清时，溶液分为三层，中间层为变性蛋白弃掉，下层氯仿可回收再利用。 所述步骤(14)具体为4°C、4000转/min离心40min，收集白色黏性沉淀。 进一步地，本专利技术针对胸腺肽及中分子量胸腺蛋白的提取提供一个完整的具体实 施方案如下： 1、原料处理:取检验合格的动物胸腺组织，用前除去脂肪、导管、外膜，先用饮用水 清洗3~5遍，再当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从胸腺组织中提取胸腺肽和中分子量胸腺蛋白的方法，其特征在于，由动物胸腺组织经匀浆、变性、冻融后，离心取上清，并经过不同截留分子量的超滤系统超滤，获得截留分子量为30KD～50KD的中分子量胸腺蛋白和截留分子量小于10KD的胸腺肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：聂玲玲，马骉，杨蓉，
申请(专利权)人：天津泰创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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