一种DNA片段的拼接方法技术

本发明专利技术提供了一种核酸片段的拼接方法，通过提供一种设计有同源臂及特定酶切位点的DNA载体；提供多个带有同源臂且相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠的待拼接的目标DNA片段；利用无缝克隆将多个待拼接的目标DNA片段一并克隆入所述的DNA载体，从而获得含有更长DNA片段的载体。本发明专利技术的方法获得的片段又可以以同样的方式与其他片段进行排接，从而可以源源不断地将更多的片段拼接在一起。在基因工程中，尤其在合成生物学中得到大段的DNA片段非常适用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学及生物工程
，涉及一种在基因工程操作中的DNA 片段克隆和拼接方法。具体地，本专利技术涉及一种将多个DNA片段首尾拼接形成更长的DNA片 段的方法及该方法的应用。
技术介绍
DNA(Deoxyribonucleic acid)，又称脱氧核糖核酸，是生命体内重要的遗传物质， 也是生命科学和生物技术研究的重要对象和工具。随着基因工程技术和应用的发展，在体 外对DNA的操作方式越来越多，比如对DNA分子的扩增、切割、修饰与重新组装等，也称为重 组DNA技术，是现代分子生物学发展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技术。 在这些体外DNA操作中，有一个重要的环节是将DNA片段连接到载体中，从而可以 利用生物(细菌、酵母、细胞等)对DNA进行扩增、筛选、表达等操作。将DNA片段连接到载体的 过程也称为狭义的DNA克隆。 可以作为DNA载体的有质粒、粘粒、噬菌体、人工染色体等，其中质粒载体是应用最 为广泛的分子克隆载体。 实现DNA片断克隆到载体中的方法也有多种。比如酶切连接的方法，即DNA分子的 切割与连接可以通过限制性内切酶和连接酶来完成，即分别用相应的限制性内切酶切割目 标DNA分子和载体DNA分子，使其两端分别获得含有部分单链突出的末端(粘性末端），含有 互补序列的末端（由同一个酶或同尾酶切割获得)在DNA连接酶的作用下形成一条完整的 DNA链。也有TA克隆的方法，即在DNA片段末端各添加一个3 ' -dA碱基，在载体末端各添加一 个3'-dT碱基，即可实现DNA片段与载体的连接。还有基于同源片段的连接方法，即在片段和 线性化的载体两端分别有相同的序列，通过酶的作用将其连接在一起。 实现单个DNA片段与载体的连接的方法相对比较简单和成熟。如上所述的方法中， 分别用一个步骤即可完成。在研究中，尤其是合成生物学应用中，经常需要用到将多个片段 连接到一起形成一个更长的DNA分子的过程，通常的方法，可以先将多个片段通过PCR的方 法连接到一起，再克隆连接到载体中。也可以先将其中的一个片段克隆到载体中，形成新 的载体后再加入新的片段。但这些方法都存在明显的缺点，PCR的方法得到的序列存在一定 的突变率，往往需要重新筛选正确克隆，而且PCR方法所能操作的DNA片段数量和长度都有 限。先后加入的方法，一方面受酶切位点的限制，随着片段的增加，可选的酶切位点越来越 少，另外一方面，遇到片段比较多的时候，该方法需要比较长的时间。 为了解决多个片段拼接的问题，尤其是大量DNA片段需要拼接形成较长的DNA分子 的问题。本专利技术提出了一种"递归"克隆的方法，根据该方法设计的载体和片段，可以方便 地，并行和递归地将多个DNA片段首尾拼接，形成大的DNA分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种将多个DNA片段首尾拼接形成更长的DNA片段的方法。 一种将多个DNA片段拼接形成更长的DNA片段的拼接方法，包括下列步骤： 1)提供一种DNA载体，所述载体上至少顺序包含四个不同的酶切位点，即酶切位点 A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D，其中，酶切位点A和酶切位点B之间设有载体左同源 臂，酶切位点C和酶切位点D之间设有载体右同源臂； 2)提供多个待拼接的目标DNA片段，相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠， 且首个待拼接目标DNA片段的首部设有与步骤1)所述DNA载体的载体左同源臂同源的左臂 序列，末个待拼接片段的尾部设有与步骤1)所述DNA载体的载体右同源臂同源的右臂序列； 3)将步骤2)所述的多个待拼接的目标DNA片段经无缝克隆的方法一并克隆入步骤 1)所述的DNA载体，获得的载体中，所述多个待拼接的目标DNA片段按照设计顺序相连。 步骤1)中，所述DNA载体的关键设计在于左右同源臂及四个酶切位点，其他设计并 无特殊，因此可以采用各种常规载体为出发载体改造获得。该载体中可包含常规载体包含 的其他酶切位点和特征序列。 本专利技术实施例所用载体以pUC57载体为出发载体改造获得。 进一步的，所述酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D均在所述DNA载体 中为唯一。 所述酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D可选自各种常规酶切位点。实 施例列举的载体中，酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D顺次分别为限制性内切 酶Sbf I、Bpi I、Esp3I和AsiS I的酶切位点。 较佳的，所述载体左臂同源序列及载体右臂同源序列的长度为15-100bp。 如实施例列举的，步骤1)所用的DNA载体的序列为SEQ ID NO: 15。优选的，无缝克隆时，步骤1)所述的DNA载体被线性化。较佳的，采用内切酶B(对应 酶切位点B)和内切酶C(对应酶切位点C)酶切线性化所述DNA载体。优选的步骤2)中，相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠的区域为15-100bp， 优选25-100bp。为防止连接顺序混乱，步骤2)中，当待拼接的目标DNA片段在两个以上时，各相邻 拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠的区域序列不同。 可选的，步骤2)中，至少一个待拼接的目标DNA片段采用包括下列步骤的方法获 得： a)提供两端附加有与步骤1)提供的DNA载体中所述载体左同源臂同源的左臂序列 及与所述载体右同源臂同源的右臂序列的待拼接的目标DNA片段； b)将步骤a)的片段经无缝克隆的方法克隆入步骤1)提供的DNA载体中，获得克隆 有待拼接的目标DNA片段的载体； c)将步骤b)获得的载体扩增后，经内切酶A和内切酶C酶切，或内切酶B和内切酶D 酶切，或内切酶B和内切酶C酶切获得所述待拼接的目标DNA片段。进一步的，步骤c)中，当所述载体克隆有首个待拼接目标DNA片段时，采用内切酶A 和内切酶C酶切；当所述载体克隆有末个待拼接目标DNA片段时，采用内切酶B和内切酶D酶 切;若待拼接目标DNA片段数目超过两个，当所述载体克隆有中间待拼接目标DNA片段时，采 用内切酶B和内切酶C酶切。进一步的，步骤3)、b)中，将DNA片段克隆到载体上以后，载体的酶切位点和特征序 列并不改变。较佳的，步骤2)中，各待拼接的目标DNA片段均采用上述方法获得。步骤3)获得克隆有拼接片段的DNA载体，可采用酶切的方式分离拼接好的DNA片 段。 本专利技术的方法可循环使用，类似递归的方式，将步骤3)获得的载体中拼接好的DNA 片段酶切后进一步作为待拼接的目标DNA片段，用于拼接更长的DNA片段，如此递归一次或 数次，从而将DNA片段源源不断地拼接到一起。 本专利技术的特点在于利用同一套载体和相应的酶切位点，结合使用无缝克隆的方 法，可以将两个或多个具有首尾重叠的DNA片段拼接到一起形成更长的片段。更重要的是， 由此拼接形成的片段又可以以同样的方式与其他片段进行排接，从而可以源源不断地将更 多的片段拼接在一起。在基因工程中，尤其在合成生物学中得到大段的DNA片段非常适用。【附图说明】图1是母载体(pMatric)结构示意图 图2是目标片段分段示意图图3是目标片段基础载体(pMatric-Block)构建示意图图4是两个片段一步拼接示意图图5是三个片段一步拼接示意图图6是四个片段一步拼接示意图图7是四个片段两步拼接示意图 图8是实施例中母本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA片段的拼接方法，包括下列步骤：1)提供一种DNA载体，所述载体上至少顺序包含四个不同的酶切位点，即酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D，其中，酶切位点A和酶切位点B之间设有载体左同源臂，酶切位点C和酶切位点D之间设有载体右同源臂；2)提供多个待拼接的目标DNA片段，相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠，且首个待拼接目标DNA片段的首部设有与步骤1)所述DNA载体的载体左同源臂同源的左臂序列，末个待拼接片段的尾部设有与步骤1)所述DNA载体的载体右同源臂同源的右臂序列；3)将步骤2)所述的多个待拼接的目标DNA片段经无缝克隆的方法一并克隆入步骤1)所述的DNA载体，获得的载体中，所述多个待拼接的目标DNA片段按照设计的拼接顺序相连。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李威，赵斯斯，何晓锐，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31