2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合制造技术

本发明专利技术涉及2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合。本发明专利技术提供了包含含有2’-终止子核苷酸的封闭的寡核苷酸的反应混合物。当通过例如焦磷酸解作用从寡核苷酸去除2’-终止子核苷酸时，封闭的寡核苷酸是可延伸的。所述反应混合物可以用于各种核酸聚合和/或扩增测定，以及许多其它应用。除了反应混合物以外，本发明专利技术也提供了有关的方法和反应混合物。

【技术实现步骤摘要】
本申请是国际申请日为2007年10月17日的国际申请PCT/EP2007/008997进入中国、申请号为200780038651.8的题为“2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术总的来说涉及核酸化学和分子生物学。更具体地，本专利技术涉及包含2’-终止子的核酸聚合和扩增。
技术介绍
焦磷酸解作用激活的聚合(PAP)是一个包含焦磷酸解作用介导的与靶或模板核酸杂交的焦磷酸解作用可激活的引物的激活，和随后延伸激活的引物的过程。焦磷酸解作用可激活的引物一般包括终止子核苷酸，例如在它们的3’-末端的双脱氧核苷酸(ddNMPs)。这些终止子核苷酸通常必须通过消耗焦磷酸的焦磷酸解作用反应从这样的杂交的、封闭的引物酶促地去除，以生成激活的引物，以使得进行引物延伸。由于引物激活一般需要完全匹配的引物和靶核酸，所以这些反应通常生成有限的(如果存在的话)非特异性产物，这归因于例如引物二聚体形成或其它错误引发假象。PAP的示例性应用包括，提供扩增核酸的替代方法(例如，作为罕见的等位基因检测方法的部分，体细胞突变检测测定等)，以及其它用途。如上面指出的，某些现有的PAP有关的方法使用ddNMP-终止的引物和有效的掺入ddNMP的热稳定的DNA聚合酶(例如，在“螺旋O”中含有“F至Y”突变的突变酶)，以在引物与模板结合/退火后在有焦磷酸(PPi)存在下，实现具有3-末端ddNMP部分的引物的焦磷酸解作用。这些方法通常具有各种缺点。例如，这些技术一般使用非常低的、限制浓度的dNTPs，这降低(减慢)延伸速率(每秒聚合的核苷酸的数目)。更具体地，当3’-末端ddNMP在这些反应中作为ddNTP释放时，非常低浓度的dNTPs(即，“库大小(poolsize)”)增加在全长引物延伸(有效的PCR所需)之前重新掺入不断增加浓度的ddNTPs的可能性(源自连续轮次的PAP)。该重新掺入通常是不希望的，这需要额外的PAP来去除掺入的ddNMP，且进一步促成不完全引物延伸和损害每个循环中全长引物延伸产物的效率。此外，许多这样的现有PAP方法能产生仅非常短的扩增子，例如，在有些情况下，甚至比引物二聚体更短。因而，这些以前的方法的PCR循环效率通常会受损，从而一般需要许多循环来检测低丰度的靶。从前面可知，显然希望其它的PAP有关的方法。本专利技术提供了使用2’-终止子核苷酸的PAP有关的方法，以及在完全阅读下面的公开内容后将显而易见的许多其它特征。
技术实现思路
本专利技术涉及核酸聚合和扩增。在某些实施方案中，例如，本文提供的PAP有关的方法包含焦磷酸解作用和聚合的连续偶联。这些方法可以用于，例如，SNP分析和罕见体细胞突变检测，以及许多其它应用。除了PAP有关的方法以外，本专利技术也提供了有关的反应混合物和系统。为了说明，本文所述的方法和其它方面增强了寡核苷酸介导的合成反应的一般特异性。例如，类似于其它“热启动”方法(例如，可逆的、化学修饰的酶、适体或抗体介导的“热启动”)，减少或消除了“零循环延伸”(PCR前)。与这些其它的方法不同，在各个和每个新的寡核苷酸介导的合成步骤中实现了引物激活。这提高反应的总特异性，从而使不希望的副产物的产生最小化。因此，提高了低拷贝和甚至单个拷贝序列的检测。另外，通过减少或消除非预期的且不希望的非特异性合成产物(例如，在PCR情况下的引物二聚体)的产生，也提高了在多重(其中扩增几个或许多不同的靶)扩增反应中的性能。在一个方面，本专利技术提供了反应混合物，其包括至少一种包含2’-终止子核苷酸(例如，在3’-末端)的寡核苷酸(例如，引物核酸、探针核酸等)。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含式：其中Z是O或CH2；B是至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基或其组合；BG是封闭基团；R1是H、OH、亲水基或疏水基；X是核苷酸或核苷酸类似物；n是大于0的整数；且，代表单键或双键。任选地，所述寡核苷酸包含至少一种标记。在某些实施方案中，所述寡核苷酸中的至少一个核苷酸位置对应着靶核酸中的多态核苷酸位置。在这些实施方案的一些中，例如，2’-终止子核苷酸对应着靶核酸中的多态核苷酸位置。反应混合物一般包括根据其中使用所述反应混合物的特定应用的其它试剂。在有些实施方案中，例如，其它试剂选自，例如，包含核苷酸去除活性(例如，焦磷酸解作用活性和/或核酸酶活性)的第一种生物催化剂，包含核苷酸掺入活性的第二种生物催化剂，至少包含与寡核苷酸至少部分互补的子序列的靶核酸、扩增子、引物核酸、探针核酸(例如，杂交探针、5’-核酸酶探针、发夹探针等)、其它核苷酸(例如，可延伸的核苷酸、终止子核苷酸、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸等)、其它寡核苷酸(例如，引物核酸、探针核酸等)、可溶的光发射改性剂、助溶剂、嵌入剂、临床样品、样品、缓冲剂、盐、金属离子、焦磷酸、甘油、二甲基亚砜、聚rA(polyrA)等。在有些实施方案中，靶核酸、扩增子、引物核酸、探针核酸、其它核苷酸和/或其它寡核苷酸包含至少一种标记。在某些实施方案中，缓冲剂包含浓度为至少90mM(例如，约95mM、约100mM、约105mM等)的N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸。在有些实施方案中，第一种生物催化剂包含核苷酸掺入活性(即，除了核苷酸去除活性以外)。第一种和/或第二种生物催化剂的核苷酸掺入活性一般包含聚合酶活性和/或连接酶活性。任选地，第一种和/或第二种生物催化剂包含核酸酶活性。为了进一步说明，第一种和/或第二种生物催化剂任选包含选自下述的酶：例如，聚合酶、末端转移酶、反转录酶、多核苷酸磷酸化酶、连接酶、脱嘌呤嘧啶内切核酸酶和端粒末端转移酶。在某些实施方案中，第一种和/或第二种生物催化剂包含在选自下述的氨基酸位置包括一个或多个突变的CS5DNA聚合酶：G46、L329、Q601、D640、I669、S671和E678。在这些实施方案的一些中，例如，所述突变包含G46E突变、L329A突变、Q601R突变、D640G突变、I669F突变、S671F突变和/或E678G突变。在本文所述的寡核苷酸中使用的2’-终止子核苷酸包括各种实施方案。在有些实施方案中，例如，2’-终止子核苷酸包含2’-单磷酸-3’-羟基核苷。为了进一步说明，在某些实施方案中，2’-终止子核苷酸包含式：其中R1是H、OH、亲水基或疏水基；B是至少一个同素环、至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
从寡核苷酸去除2’‑终止子核苷酸的方法，该方法包含：与下述物质一起温育至少一种靶核酸：焦磷酸；至少包含焦磷酸解作用活性的第一种生物催化剂，和至少一种包含2’‑终止子核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸与靶核酸的至少第一个子序列至少部分地互补，所述温育在第一种生物催化剂从寡核苷酸去除至少2’‑终止子核苷酸以生成去除的2’‑终止子核苷酸和缩短的寡核苷酸的条件下进行，从而从寡核苷酸去除核苷酸，其中所述第一种生物催化剂具有校正3’‑5’外切核酸酶活性。

【技术特征摘要】
2006.10.18 US 11/5836061.从寡核苷酸去除2’-终止子核苷酸的方法，该方法包含：
与下述物质一起温育至少一种靶核酸：
焦磷酸；
至少包含焦磷酸解作用活性的第一种生物催化剂，和
至少一种包含2’-终止子核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸与靶核酸
的至少第一个子序列至少部分地互补，
所述温育在第一种生物催化剂从寡核苷酸去除至少2’-终止子核苷
酸以生成去除的2’-终止子核苷酸和缩短的寡核苷酸的条件下进行，从
而从寡核苷酸去除核苷酸，
其中所述第一种生物催化剂具有校正3’-5’外切核酸酶活性。
2.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含在寡核苷酸的3’-
末端的2’-终止子核苷酸。
3.权利要求1的方法，其中所述2’-终止子核苷酸不可被一种或
多种选自下述的核苷酸掺入生物催化剂延伸：G46EE678GCS5DNA
聚合酶，G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640G
S671FCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA
聚合酶，G46EE678GCS6DNA聚合酶，ΔZO5R聚合酶，E615GTaq
DNA聚合酶，黄栖热菌(Thermusflavus)聚合酶，TMA-25聚合酶，
E678GTMA-25聚合酶，TMA-30聚合酶，E678GTMA-30聚合酶，
TthDNA聚合酶，栖热菌属(Thermus)物种SPS-17聚合酶，E615GTaq
聚合酶，栖热菌属ZO5R聚合酶，T7DNA聚合酶，KornbergDNA聚
合酶I，克列诺DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶，微球菌DNA聚合酶，
αDNA聚合酶，反转录酶，AMV反转录酶，M-MuLV反转录酶，DNA
聚合酶，RNA聚合酶，大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶，SP6RNA聚
合酶，T3RNA聚合酶，T4DNA聚合酶，T7RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：DH格尔范德，KA鲍尔，AP古普塔，V博德普迪，J尼米克，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH