本公开内容涉及富集样品中相对于相应的非靶核酸序列或参考核酸序列以低丰度存在的靶核酸序列。特别地，该方法通过靶序列的数量级程度的富集允许显著更高水平的检测灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】核酸序列的合成和富集 相关申请的夺叉引用 本申请要求2013年10月20日提交的美国临时申请号61/893, 283、2013年11 月14日提交的美国临时申请号61/904, 141和2014年8月20日提交的美国临时申请号 62/039, 905的权益，其全部通过引用并入本文。本公开内容的领域BRAF和KRAS中的突变是赋予癌细胞存活和生长优势的遗传改变的实例。这样的 遗传改变可用于靶向治疗的选择。但在受试者中，这些改变的存在远超过未改变的野生型 序列。 本公开内容涉及合成和富集包含一个或更多个改变或突变的靶核酸序列；靶序列 以相对于生物样品中存在的高度相似的野生型序列低的丰度存在。靶核酸序列的优先和特 异性富集提供以前没有实现的显著灵敏的检测水平。所公开的方法还允许定量检测靶序 列。本公开内容的背景 许多疾病且特别是癌症，与基因突变诸如单点突变、少量碱基对插入/缺失等相 关。几乎所有目前用于检测这些罕见的等位基因的方法依赖于聚合酶链式反应（PCR)。然 而，基于PCR的方法的主要局限性是其低的灵敏度和优先扩增正常（野生型）序列，因为正 常（野生型）序列在样品内的相对丰度较大。通常，直到突变等位基因呈现大于总等位基 因的5%-10%时，其才可能被检测到。因此，当变体序列相对于非变体（靶）序列以低百 分比存在时，在野生型DNA序列的背景中检测基因突变的能力是有益且高度希望的。 允许选择性扩增突变基因，而不需要扩增后测序测定的改良的PCR方法已 被描述。这样的方法包括Restrictionendonuclease-mediatedselectivePCR:a novelassayforthedetectionofK-rasmutationsinclinicalsamples. AmJPathol153:373-379,Detectionoftumormutationsinthepresenceof excessamountsofnormalDNA.NatBiotechnol20:186-189lockednucleic acid"C0LD-PCR(co-amplicationatlowerdenaturationtemperaturePCR)(Li,J., 等人，2008.ReplacingPCRwithC0LD-PCRenrichesvariantDNAsequences andredefinesthesensitivityofgenetictesting.NatMed14:579-584·)， US20130149695(Methodfordetectinggeneticmutationbyusingablocking primer)，US8623603(Fullcold-PCRenrichmentwithreferenceblockingsequence)； USPN8455190(Enrichmentofatargetsequence) ；W02003072809(MeltingTemperature DependentDNAAmplification)以及其他文献。COLD-PCR技术的执行相对简单，但具有低的扩增倍数（3-100X)和低的对于 微小温度变化的灵敏度（Li,J·，等人，2008.ReplacingPCRwithCOLD-PCRenriches variantDNAsequencesandredefinesthesensitivityofgenetictesting.Nat Med14:579-584,Luthra，R·，等人，2009.COLD-PCRfindshotapplicationinmutation analysis.ClinChem55:2077-2078)。其他方法，诸如在Molloy等人（W02003072809)中 描述的方法需要使用较低的变性温度以选择性扩增靶序列。因此Molloy仅适用于具有比 其野生型序列低的解链温度（TJ的那些靶序列。 癌性组织、循环细胞中的核酸和体液中存在的无细胞（cf)的核酸可有助于鉴定 和选择患有与此类遗传改变相关的癌症或其他疾病的个体。BRAF和KRAS中的突变是赋予 癌细胞存活和生长优势的遗传改变的实例。这样的遗传改变可用于靶向治疗的选择。但在 受试者中，这些改变的存在远超过未改变的野生型序列。参见，例如，Spindler等人，2012;Benesova等人，2013;Dawson等人，2013; Forshew等人，2012 ;Shaw等人，2012。一些数据表明，突变DNA在血液中的量与肿瘤负荷相 关，且可用于确定抗性突变的出现（Forshew等人，2012 ;Murtaza等人，2013 ;Dawson等人， 2013;Diaz等人，2012;Misale等人，2012;Diehl等人，2008)。 存在对另外的方法的需要，通过这些方法可有效且容易地实现靶序列的更大灵敏 度和/或富集。本专利技术解决了该需要。 本公开内容的概沐 本公开内容部分地基于开发用于大量富集和检测低丰度核酸序列（靶序列），诸 如非正常存在于具有天然核酸、DNA、或RNA序列的背景的生物样品中的改变的、突变的、非 野生型核酸序列或其他核酸的方法，所述方法利用更少的步骤并大大减少反应测定时间， 同时仍顾及到检测低丰度核酸序列的更高数量级的灵敏度。开发该方法使得能够富集以 短的、片断化形式存在的突变序列（<50bp)，且该方法还适于扩增片段化程度较小的序列 (>50bp)。本方法的应用允许在高的非靶核酸或野生型核酸背景中富集低丰度核酸序列， 使得可在生物样品中检测到少至单拷贝的靶序列。富集基于靶序列量的相对增加，通过其 相对于同一生物样品中存在的其他核酸的优先扩增和由此而来的显著更多（700X- 10000X 倍以及更大的倍数）的富集。 在第一方面，本公开内容提供了用于在扩增反应混合物中富集靶核酸序列的方 法。所述方法可包括a)制备包含核酸样品和过量的参考阻断核酸序列的扩增反应混合物，所述核酸样 品包含参考（任选地野生型）序列并且至少被怀疑具有一个或更多个与参考序列至少50% 同源并且还可通过与参考序列相同的引物对扩增的靶（任选地突变体）序列，并且所述参 考阻断核酸序列在参考序列的引物位点之间与参考序列的一条链的序列的至少一部分完 全互补；b)将反应混合物的温度升至第一变性温度，所述第一变性温度高于参考序列的解 链温度（TJ且高于双链靶序列的解链温度（TJ以形成变性的参考链和变性的靶链；c)降低反应混合物的温度以允许形成参考阻断序列和互补的参考链的双链体以 及参考阻断序列和靶链的异源双链体；d)将反应混合物的温度升至临界温度（Tc)，所述临界温度足以允许参考阻断序 列和靶链的所述异源双链体优先于参考阻断序列和参考链的双链体的变性的优先变性； e)降低反应混合物的温度以允许引物对退火至反应混合物中的变性的靶链和任 何变性的参考链； f)将反应混合物的温度升至高于参考序列的解链温度（TJ且高于双链靶序列的 解链温度（TJ以形成变性的参考链和变性的靶链的变性温度以在反应混合物中延伸退火 至所述变性的靶链和变性的参考链的引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于在疑似包含一个或更多个低丰度靶序列的核酸样品中富集靶核酸序列的方法，所述方法包括：a.制备反应混合物，所述反应混合物包含：参考序列、相对于所述混合物中的参考序列的量过量的阻断序列和疑似包含的一个或更多个靶序列，其中：所述靶序列与所述参考序列至少50％同源；所述阻断序列与所述参考序列的区域完全互补，所述参考序列的所述区域在所述靶序列之中或与所述靶序列重叠；b.使所述反应混合物经受两个或更多个循环的以下步骤：i.将所述反应混合物的温度加热至预选的变性温度(Tsd)，所述Tsd允许但不要求退火至参考序列的阻断物序列的变性，其中所述Tsd高于计算的参考序列‑阻断物序列双链体的解链温度，和ii.将所述反应混合物的温度降低至延伸温度，所述延伸温度允许引物退火和一条或更多条引物从它的互补靶序列延伸以形成富集的靶序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：詹森·普尔，赛格·汉考克，卡伦纳·科斯科，弗拉达·梅尔尼科娃，彼得·裘槎，蒂姆·卢，马克·G·厄兰德，艾琳·萨穆埃尔兹，
申请(专利权)人：特罗瓦基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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