人广泛自我更新型成红细胞(ESRE)制造技术

本发明专利技术提供了一种可广泛地自我更新并且仍保持分化为红血细胞(RBC)的能力的人细胞群。这些细胞称为广泛自我更新型成红细胞(ESRE)。本发明专利技术的所述细胞尤其用作可输注RBC的可再生源。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】人广泛自我更新型成红细胞（ESRE) 关于联邦赞助研究或开发的声明 本专利技术在国立卫生研究院（NIH)颁发的UOl HL099656下借助政府资助进行。政 府具有本专利的某些权利。 相关申请的交叉引用 本申请要求2014年5月15日提交的美国临时申请序列号61/823, 677的优先权， 其通过引用整体并入本文。 专利技术背景 在美国每年输注超过1600万个单位的红血细胞（RBC)以满足外伤、手术或癌症化 疗后危重患者的临床需要。目前，输注用RBC的供给仅仅依赖于捐赠者，这尤其是对于稀有 血型而言，伴有感染风险、高筛选成本和供给瓶颈。在接下来的几十年，对红细胞输注的需 要将随着美国人口老龄化而增加。因此，需要用于输血的替代来源。 使用基于胚胎干（ES)细胞的方法生成红细胞受可量测性和有限的生成红细胞祖 细胞的方法限制。虽然先前技术已经使用了骨髓源性和脐血源性造血干细胞，但尚未实现 红系祖细胞的可用产生。相反，存在用于红系祖细胞终末分化和去核的技术，然而，"起始细 胞"的大量产生尚未成功（Giarratana，2011)。本专利技术解决了本领域中这种未满足的需要。 专利技术概要 本专利技术提供了一种在培养中增殖并且保持最终成熟的能力的人广泛自我更新型 成红细胞（ESRE)分离群，其中ESRE未永生化。 在一个实施方案中，ESRE群能够经历至少30次细胞分裂。 在一个实施方案中，ESRE群源自定形红系祖细胞群，进一步地其中ESRE群与经历 限制性自我更新的成红细胞和原代原成红细胞相比表现出更高的Bmi-I表达水平。 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以表达一种或多种治疗性蛋白。 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以表达选自因子IX、因子VIIIc、温韦伯氏因 子（von Willebrand' s factor)、组织型纤溶酶原活化物、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III及 其任何组合的因子。 本专利技术还提供了一种组合物，其包含人ESRE分离群及包含Epo、SCF、地塞米松和 脂质混合物的扩增培养基。 在一个实施方案中，扩增培养基还包含Bmi-I蛋白、Bmi-I肽和Bmi-I调节剂中的 一种或多种。 本专利技术还提供了一种源自ESRE群的人RBC分离群。 本专利技术还提供了一种由人细胞生成基本上纯的ESRE群的方法。在一个实施方案 中，该方法包括a)在促进分化细胞群生成的条件下培养人细胞，b)使分化细胞群在包含 Epo、SCF、地塞米松和脂质混合物的扩增培养基中扩增，从而生成基本上纯的ESRE群。 在一个实施方案中，人细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干（iPS)细胞、成体干细 胞、脐血细胞、骨髓细胞及其组合。 在一个实施方案中，步骤a)中的分化细胞群源自类胚体（EB)。 在一个实施方案中，在步骤a)中，细胞经培养以产生定形红系祖细胞群。 在一个实施方案中，细胞在步骤a)中培养至少约20天。 在一个实施方案中，在步骤b)中，ESRE群连续经历自我更新细胞分裂至少约45 天。 在一个实施方案中，在步骤b)中，按足以调节红系细胞自我更新的量向分化细胞 群提供Bmi-I蛋白、Bmi-I肽和Bmi-I调节剂中的一种或多种。 在一个实施方案中，Bmi-I调节剂为刺猬因子配体。 在一个实施方案中，扩增培养基为补充了 2U/mL Epo、约lOOng/mL人重组SCF、约 10 6M地塞米松、约40ng/mL人重组胰岛素样生长因子-1和约0. 4%脂质混合物的无动物组 分培养基。 本专利技术还提供了一种向哺乳动物递送基因的方法。在一个实施方案中，该方法包 括向哺乳动物施用基因递送媒介物，其中媒介物包含经遗传修饰的ESRE。 本专利技术还提供了一种生成人红血细胞（RBC)的方法。在一个实施方案中，该方法 包括在包含EPO和胰岛素的分化培养基中培养ESRE。 本专利技术还提供了一种治疗有RBC输注需要的受试者的方法。在一个实施方案中， 该方法包括向受试者施用源自ESRE群的人RBC分离群。 在一个实施方案中，RBC由从受试者获得的细胞生成。 在一个实施方案中，从受试者获得的细胞选自胚胎干细胞、iPS细胞、成体干细胞、 脐血细胞、骨髓细胞及其任何组合。 本专利技术还提供了一种治疗患有血液病的受试者的方法。在一个实施方案中，该方 法包括向受试者引入治疗有效量的ESRE。 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以表达一种或多种因子以便治疗患有血液病 的受试者。 在一个实施方案中，血液病为血友病。 在一个实施方案中，因子选自因子VIII或因子Villa、因子V、因子Va、因子IX、因 子X、因子XI、因子XII、因子XIII、温韦伯氏因子、组织型纤溶酶原活化物、蛋白C、蛋白S、 抗凝血酶III及其任何组合。 本专利技术还提供了一种筛选调节ESRE基因表达的测试化合物的方法。在一个实施 方案中，该方法包括使ESRE与测试化合物接触并且当测试化合物存在时的基因表达水平 不同于测试化合物不存在时的基因表达水平时，将该化合物鉴定为ESRE基因表达的调节 剂。 在一个实施方案中，ESRE经遗传修饰以包含编码与珠蛋白基因启动子可操作性连 接的可检测多肽的核酸序列。 在一个实施方案中，珠蛋白基因启动子选自人γ-珠蛋白基因启动子和人β-珠 蛋白基因启动子。 在一个实施方案中，可检测多肽选自荧光素酶、荧光蛋白、红色荧光蛋白、磷酸酶、 过氧化物酶、激酶、氯霉素转移酶和半乳糖苷酶。 在一个实施方案中，该方法包括测量在测试化合物存在和不存在时的可检测多肽 水平，其中与测试化合物不存在时的可检测多肽水平相比，测试化合物存在时的可检测多 肽水平增加将该测试化合物鉴定为活化珠蛋白基因启动子的化合物。 在一个实施方案中，该方法包括测量在测试化合物存在和不存在时的可检测多肽 水平，其中与测试化合物不存在时的可检测多肽水平相比，测试化合物存在时的可检测多 肽水平降低将该测试化合物鉴定为抑制珠蛋白基因表达的化合物。 在一个实施方案中，测试化合物选自小分子、核酸分子、多肽、合成化合物和天然 存在的化合物。 附图简述 连同附图一起阅读时会更好地理解以下对本专利技术优选实施方案的详细描述。为了 说明本专利技术的目的，在图中示出了目前优选的实施方案。然而，应理解，本专利技术不限于图中 所示实施方案的精确布置和手段。 图1，包括图IA和1B，为显示哺乳动物红细胞生成的一系列图像。（图1A)体内 稳态红细胞生成的特征在于去核形成网织红细胞（网状细胞）的红系定向祖细胞（BFU-E、 CFU-E)和红系前体细胞（ProE、BasoE、PolyE和OrthoE)的有限扩增。（图1B)脐血和成体 骨髓的离体培养产生自我更新能力有限的成红细胞。 图2,包括图2A和2B，为显示鼠广泛自我更新型成红细胞（ESRE)的一系列图像。 (图2A)来自于成体骨髓的成红细胞培养物展示出有限的自我更新。相反，来自于E9. 5小 鼠卵黄囊和E14. 5肝脏的成红细胞培养物经历广泛自我更新。（图2B)增殖成红细胞表达 出高水平的c-Kit并且具有原成红细胞形态。分化后，TER119表达增加并且细胞成熟为网 织红细胞。 图3为显示IV注射了来自于小鼠骨髓（LSK)的未成熟骨髓造血祖细胞或源自 UBC-GFP小鼠的ESRE的NSG小鼠中网织红细胞和成熟R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在培养中增殖并且保持最终成熟的能力的人广泛自我更新型成红细胞(ESRE)分离群，其中所述ESRE未永生化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·帕利斯，萨曼莎·英格兰，金雅然，
申请(专利权)人：罗切斯特大学，
类型：发明
国别省市：美国;US