本发明专利技术公开了一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，该方法是以海藻酸钠和聚乙烯醇（PVA）为基体，与施氏假单胞菌菌体的生理盐水悬浮液混合，混匀后注入CaCl2溶液中，固化得到。本发明专利技术所述的施氏假单胞菌细胞固定化方法工艺简单，固定化细胞颗粒机械强度高，弹性好，水解活性高，在反应体系中耐受性强。本发明专利技术方法得到一种新型的具有高效水解活力的固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程技术应用领域，具体涉及。
技术介绍
固定化细胞技术是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，是在固定化酶的基础上发展起来的新技术。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。通过各种方法将细胞和水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。与游离的细胞相比，固定化的细胞具有显著的优点:1)固定化可以提高菌体的稳定性；2)固定化细胞易于分离进而简化产物的分离纯化；3)可以获得更高的细胞浓度；4)细胞的种类多种多样，大小和特性各不相同，故此细胞固定化的方法有很多种，固定化的方法主要有吸附法、包埋法、交联法。吸附法是利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法，用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。包埋法是将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。交联法是依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶，常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。
技术实现思路
本专利技术目的在于进一步优化现有技术，提供一种高效水解活力施氏假单胞菌细胞的固定化方法。本专利技术通过以下技术方案来实现: ，包括以下步骤: (1)施氏假单胞菌经活化培养、发酵培养得到菌液，菌液离心分离得菌体，菌体干燥备用； (2)将步骤(1)得到的菌体接入经高压灭菌冷却的海藻酸钠与PVA的混合溶液中，混匀后注入搅拌的饱和硼酸_CaCl2溶液中固定化，过滤得到小珠后用蒸馏水洗涤，再经冷冻干燥制得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。进一步地，步骤(1)所述施氏假单胞菌为stutzeri GIM1.273，购自广东省微生物研究所。进一步地，步骤(1)所述发酵培养的培养基中各成分的质量体积分数为:葡萄糖0.1 %~5 %，酵母浸膏 0.1 %~5 %，(NH4)2S04 0.2 %~3 % g，Κ2ΗΡ04 0.02 %~1 %g，MgS04.7H200.002 %~0.2 %，其余成分为水；培养基中初始pH值为6.0-8.0。进一步地，步骤(1)所述发酵培养条件为温度20 °C -40 °C，转速120~200 r/min，震荡培养0.5 d~3 do进一步地，所述细胞固定化采用包埋法-交联法联合使用的方法。进一步地，步骤(2)所述的海藻酸钠与PVA在混合溶液中的质量体积分数分别为0.5 %~8 % 与 0 %~12 %。进一步地，步骤(2)所述的海藻酸钠与PVA的混合溶液为固定化载体，其中固定化载体与施氏假单胞菌干重比为(50 ~ 250): 1。进一步地，步骤(2)所述的饱和硼酸_CaCl2溶液为交联剂，所述交联剂中CaCl 2浓度为0.05 mol/L~l.0 mol/L，硼酸为饱和硼酸溶液。进一步地，步骤(2)所述固定化的温度为0 °C~ 10 °C，固定化的时间为0.5 h~24ho进一步优化地，本专利技术的目的通过以下技术方案实现: (1)施氏假单胞菌的获取:将施氏假单胞菌活化后接种至诱导培养基中，接种量为1%~10 % (v/v)，培养温度为25 °C -40 °C，转速为120~200 rpm，培养时间为12 h~72 h，高速冷冻离心分离得到菌体，离心温度为0°C ~12°C，转速为8000 rpm~13000 rpm,经真空冷冻干燥6~48 h，悬浮于生理盐水中； (2)配制海藻酸钠与PVA的混合溶液，并进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件是121°C, 10-30min，冷却备用； (3 )将步骤(1)所得菌悬液加入步骤(2 )所得的混合溶液中，涡旋振荡混匀，得混合物； (4)用注射器将步骤(3)得到的混合物匀速注入硼酸-CaCl2S液中，0 °C~ 4 °C下固定化0.5 h~24 h，过滤干燥制得施氏假单胞菌固定化细胞； 进一步地，步骤(1)所述的施氏假单胞菌活化培养的具体操作为:从试管保存的菌种中挑1~2环至50~200 mL营养肉汤培养基中震荡培养，培养温度为25~40°C，培养时间为6h~48 h ； 进一步地，步骤(1)所述的诱导培养基为葡萄糖0.1 %~5 % (w/v，下同)，酵母浸膏0.1%~5 %，(NH4)2S04 0.2 %~3 % g, Κ2ΗΡ04 0.02 %~1 %g, MgS04*7H20 0.002 %~0.2 %，其余成分为水；初始pH值6.0 ~ 8.0，培养温度为25~40°C，培养时间为6 h~48 h ； 进一步地，步骤(2)所述的海藻酸钠与PVA的混合溶液为固定化载体，其中各物质的质量体积分数分别为:海藻酸钠0.5 %~8 %、PVA 0 %~12 % ； 进一步地，步骤(3)的固定化载体与菌体干重比为(50 ~ 250): 1 ； 进一步地，步骤(4)所述的硼酸-CaC12溶液为饱和硼酸和0.05-1.0 mol/L CaCl2S液； 进一步地，步骤(4)所述的固定化过程中需慢速搅拌硼酸_CaCl2溶液； 进一步地，步骤(4)所述的干燥方法为真空冷冻干燥，干燥时间为6 h~48 ho本专利技术具有以下的优点: 1、本专利技术制备固定化细胞生物制剂的方法简便，联合采用了包埋法和交联法，细胞不易渗透，并且传质性能好，同时增加了机械强度。2、本专利技术制备的固定化细胞具有处理效率高、水解活性高、稳定性强、易于分离回收循环利用等优点。【具体实施方式】 为更好理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术做进一步地详细说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本专利技术保护范围的限制。实施例1 将Pseudomoms stutzeri GIM1.273 (购自广东省微生物研究所)种子液接种到发酵培养基中，接种量为1 % (v/v), 35 °C，150 rpm条件下培养24 h，在10 °C下以8000 rpm离心10 min后得到所需菌体，真空冷冻干燥24 h。固定化载体为100mL海藻酸钠和PVA的混合溶液，其中海藻酸钠的质量体积分数为2%，PVA的质量体积分数为5%，固定化载体经高压蒸汽灭菌后冷却至室温，按固定化载体:施氏假单胞菌干重=100:1加入菌粉，涡旋振荡混匀后用注射器匀速注入200mLCaCl2浓度为0.3 mol/L的饱和硼酸-CaCl 2溶液中，4°C固定化6 h，得到的小珠经100目滤布过滤后，用蒸馏水洗去表面未固定的细胞和Ca2+，干燥，得到浅黄色小珠，为固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。菌种培养方法:种子培养基，营养肉汤；发酵液培养基(w/v)为1 %葡萄糖，1 %酵母浸膏，1.2 %(NH4)2S04，0.1 % Κ2ΗΡ04，0.01 % MgS04.7H20，其余成分为水；pH 为 7.0 土0.Ιο采用以下方法测定固定化施氏假单胞菌细胞催化剂的水解活力，包括以下操作:在10 mL反应瓶中加入0.6 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS，50 mM, pH 8.0),0.1 mL溶于异丙醇的p-NPP溶液，混合均勾，再置于40°C，180 rpm预热5 min,加入50 mg上述所得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂，40 °C，180 rpm反应10 min，立即加入Na2C0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：施氏假单胞菌经活化培养、发酵培养得到菌液，菌液离心分离得菌体，菌体干燥备用；（2）将步骤（1）得到的菌体接入经高压灭菌冷却的海藻酸钠与PVA的混合溶液中，混匀后注入搅拌的饱和硼酸‑CaCl2溶液中固定化，过滤得到小珠后用蒸馏水洗涤，再经冷冻干燥制得固定化施氏假单胞菌细胞催化剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓凤，雷发玲，辛璇，赵光磊，吴晖，余以刚，唐诗潮，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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