植物中的烟草特异性亚硝胺降低制造技术

在一个方面，本发明专利技术提供了突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，其包含：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少60％序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少60％序列同一性；或(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体；并且其中与对照植物相比较，多核苷酸或多肽的表达或活性是调节的，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平是调节的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术公开了来自烟草属(Nicotiana)的编码CLC氯化物通道家族成员的基因的新型多核苷酸序列，以及其变体、同系物、片段和突变体。本专利技术还公开了多核苷酸序列以及其变体、同系物、片段和突变体。本专利技术还公开了这些基因中的一种或多种的表达或由其编码的蛋白质活性的修饰，以调节植物或其组分部分中的烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平。
技术介绍
烟草特异性亚硝胺(TSNA)主要在烟叶烘烤和加工期间形成。烟草烘烤是带出每个烟草品种的香气和风味的物理和生物化学变化过程。认为烘烤的烟叶中的TSNA量取决于亚硝酸盐的累积，所述亚硝酸盐在植物细胞的死亡期间累积，并且通过在接近厌氧(氧缺乏)环境的条件下的硝酸盐还原而在烘烤期间形成。硝酸盐至亚硝酸盐的还原被认为通过在厌氧条件下在叶表面上的细菌作用而发生，并且该还原在某些条件下特别显著。一旦形成亚硝酸盐，这些化合物就被认为与多种烟草生物碱包括含吡啶化合物组合，以形成亚硝胺。四种主要的TSNA，即通常发现以最高浓度存在的那些，是N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)。次要化合物，即通常以显著低于主要TSNA的水平发现的那些，包括4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)丁醛(NNA)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)和4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)。至少NNN和NNK据报道当应用于实验室研究中的动物时是致癌的。使负责生物碱至TSNA的亚硝化的化合物浓度下降可导致烘烤叶中的TSNA水平减少。烟叶中的主要亚硝化试剂是亚硝酸盐(NO2-)，起因于游离硝酸盐(NO3-)在烘烤期间通过可能由细菌催化的酶促反应的还原。改变白肋(Burley)植物中的硝酸盐水平的肥料研究导致烘烤叶和烟中的不同TSNA水平。硝酸盐是土壤中可获得的主要氮源。在植物中，它通过根表皮细胞吸收且转运至全植物，以首先还原为亚硝酸盐，所述亚硝酸盐进一步还原为氨，且随后同化成氨基酸。不幸的是，在白肋生长期间的氮限制导致不利的农业表型，例如弱生物质得率和植物成熟中的延迟，并且因此不是商业上可行的降低TSNA水平的方法。尝试操纵烟叶中的硝酸盐累积是重大挑战。WO98/58555描述了在烟熏之前或烟熏期间通过微波处理烟叶用于降低TSNA。US5,810,020描述了通过使烟草材料与捕集槽接触用于去除来自烟草的TSNA的方法，其中所述捕集槽包含选择过渡金属络合物，其容易亚硝化以形成亚硝酰基复合物，伴随很少的动力学或热力学阻力。US6,202,649描述了通过尤其在受控环境中烘烤烟草，基本上阻止TSNA形成的方法，所述受控环境具有足够的气流以基本上阻止环绕烟叶附近的厌氧条件。受控环境通过控制一种或多种烘烤参数而提供，所述一种或多种烘烤参数例如气流、湿度和温度。然而，诸如此类的方法可增加相当大的烟草生产成本和时间，并且因此不太可能由烟草行业接受。因此，仍存在用于降低TSNA的有效和相对廉价方法的需要。用于降低植物中的TSNA水平的基于分子的方法是高度期望的，因为它们不需要昂贵且通常复杂的方法来实现TSNA水平的降低。一种此类基于分子的方法公开于WO2011/088180中。公开了用于抑制根特异性烟碱脱甲基酶多肽的表达或功能的组合物和方法，所述根特异性烟碱脱甲基酶多肽涉及烟草植物的根中的烟碱至去甲烟碱的代谢转化。公开了CYP82E10烟碱脱甲基酶基因的基因序列。发现降低该基因的表达降低烘烤烟叶中的NNN水平。虽然可获得NNN水平的降低，但存在超过一种据报道是致癌物的TSNA，其仍保存于经修饰的植物中。其他烟碱脱甲基酶基因包括参与烟碱至去甲烟碱转化的CYP82E4和CYP82E5，且描述于WO2006091194、WO2008070274和WO2009064771中。本领域存在开发用于降低烘烤烟叶中的TSNA水平的基于分子的策略的持续需要。本专利技术寻求解决这一需要。
技术实现思路
本专利技术人已克隆了来自属于烟草属的植物，编码CLC氯化物通道家族的多个成员的新型基因，并且指名为CLC-Nt2和NtCLCe。源于两个祖先绒毛状烟草(N.tomentosiformis)和美花烟草(N.sylvestris)的两个直向同源基因拷贝存在于普通烟草(Nicotianatabacum)中，并且在本文中分别指名为CLC-Nt2-t和CLC-Nt2-s或NtCLCe-t和NtCLCe-s。这些基因的多核苷酸序列在SEQIDNOs:1-4、10和11中阐述，并且这些基因的多核苷酸序列在SEQIDNOs:5-7和12-14中阐述。通过降低这些基因在烟草植物中的表达，可见植物中的硝酸盐水平的降低。特别地，可见在绿叶中的硝酸盐水平的降低。在叶烘烤后的总TSNA含量在这些植物中是降低的。这提示硝酸盐水平降低可促使烘烤的植物材料-例如烘烤的叶中形成更低水平的TSNA。本专利技术人出乎意料地发现：在来自NtCLCe-RNAi和CLC-Nt2-RNAi植物两者的烘烤的植物材料中，可见至少NNK的降低。还观察到总TSNA含量中的降低。降低NtCLCe和/或CLC-Nt2的表达因此促成降低烟叶中的硝酸盐水平。在烘烤后，可降低至少NNK和任选的其他TSNA，其可包括NNN或NAB或NAT或者其中两种或更多种的组合。另外，植物的视觉外观基本上不改变，这是由行业接受且使植物得率达到最大等等的重要标准。另外，生物质水平基本上不改变，这是由行业接受且使植物得率达到最大等等的另一重要标准。本专利技术因此可特别用于调节(例如增加或减少)植物中的硝酸盐或总TSNA水平，包括至少NNK。特别地，当与其他能够降低TSNA水平的方法组合时，本专利技术可以是特别有用的。因此，在某些实施例中，可能期望降低烟草植物中的本文所述一种或多种多核苷酸的表达，连同降低一种或多种烟碱脱甲基酶基因的表达。该组合将预期降低烘烤的植物材料中的至少NNK和NNN水平，这将是高度期望的，因为NNK和NNN两者据报道当应用于实验室研究中的动物时是致癌的。源自本文描述的烟草植物的烟草产品可用于降低这些烟草产品的致癌潜力且降低人对致癌亚硝胺的暴露的方法中。本专利技术还描述了可调节植物中的硝酸盐含量的本文所述多肽序列的突变体。本专利技术的方面和实施例本专利技术的方面和实施例在所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，其包含：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少60％序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少60％序列同一性；或(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述多核苷酸或所述多肽的表达或活性是调节的，并且其中与含有所述对照植物细胞的所述对照植物相比较，含有所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的所述突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平是调节的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.21 EP 12198966.91.一种突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，其包含：
(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码
CLC氯化物通道家族的成员，并且与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQID
NO:3或SEQIDNO:4或SEQIDNO:10或SEQIDNO:11具有至少60％序列同
一性；
(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；
(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC
氯化物通道家族的成员，并且与SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或SEQIDNO:7
或SEQIDNO:12或SEQIDNO:13或SEQIDNO:14具有至少60％序列同一性；
或
(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达
载体，
并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述多核苷酸或所述多
肽的表达或活性是调节的，并且其中与含有所述对照植物细胞的所述对照植物
相比较，含有所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的所述突变型、非
天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平是调节的。
2.根据权利要求1所述的突变型植物细胞，其中所述突变型、非天然存在
的或转基因植物细胞包含一个或多个突变，与含有所述对照植物细胞的所述对
照植物相比较，所述一个或多个突变减少含有所述突变型、非天然存在的或转
基因植物细胞的所述突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平，适
当地，其中所述一个或多个突变包含在SEQIDNO:5的位置G163处的置换突
变；或
其中所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞包含一个或多个突变，
与含有所述对照植物细胞的所述对照植物相比较，所述一个或多个突变增加含
有所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的所述突变型、非天然存在的
或转基因植物中的硝酸盐水平，适当地，其中所述一个或多个突变包含在SEQ
IDNO:13的位置P143处的置换突变。
3.一种突变型、非天然存在的或转基因植物或其组分，其包含根据权利要
求1或权利要求2所述的植物细胞。
4.一种用于调节植物或其组分的至少硝酸盐含量的方法，所述方法包括下
述步骤：
(a)调节下述的表达或活性：
(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码
CLC氯化物通道家族的成员，并且与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQID
NO:3或SEQIDNO:4或SEQIDNO:10或SEQIDNO:11具有至少60％序列同
一性；
(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或
(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC
氯化物通道家族的成员，并且与SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或SEQIDNO:7
或SEQIDNO:12或SEQIDNO:13或SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·博韦，P·坎帕尼，
申请(专利权)人：菲利普莫里斯产品有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH