一种同时拆分烟草特有亚硝胺手性分子的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种同时拆分烟草特有亚硝胺手性分子的方法，它通过将气相色谱热能分析仪中的分析柱设计成两根，其中一根为手性色谱柱，另一根为中等极性色谱柱，这样在分析时中等极性色谱柱能够起到将NNN与NAB、NAT分离开的作用，因此在实验中即可省去采用高效液相色谱分离这一实验步骤，避免由于采用高效液相色谱分离产生的分析工作繁琐，分析时间长，以及样品损失影响样品检出限的问题，具有拆分效果好，准确性高等优点，可以用于烟草样品中烟草特有亚硝胺手性组成的分析，为烟草原料中的烟草特有亚硝胺组成优化研究提供支持，也可以为今后NAB和NAT不同手性分子的有害性研究做技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种同时拆分烟草特有亚硝胺手性分子的分析方法
本专利技术涉及一种烟草特有亚硝胺手性分子的分析方法，属于烟草分析化学领域。
技术介绍
烟草特有的亚硝胺（TSNAs）是一组有致癌性的物质。TSNAs存在于烟叶和烟气中，主要包括N´-亚硝基去甲基烟碱(NNN)，4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，N´-亚硝基假木贼碱(NAB)和N´-亚硝基新烟碱(NAT)。它们主要是烟草的生物碱在收获后的调制过程中经过亚硝化反应形成的（Bush,L.P.etal.(2001)Formationoftobacco-specificnitrosaminesinair-curedtobacco.RecentAdv.Tob.Sci.,27,23–46.；Djordjevic,M.Vetal.(1989)Tobacco-specificnitrosamineaccumulationanddistributioninflue-curedtobaccoalkaloidisolines.J.Agric.FoodChem.,37,752–756.）。一般情况下NNN和NAT的含量较其它两个含量高，而NNN和NNK在四个烟草特有亚硝胺中的致癌性更高。除了NNK，NNN、NAT和NAB都是手性分子。有研究发现NNN的两个手性分子的有害性是不同的(Lao,Y.etal.(2007)AnalysisofpyridyloxobutylDNAadductsinF344ratschronicallytreatedwith(R)-and(S)-N′-nitrosonornicotine.Chem.Res.Toxicol.,20,246–256.；Zhao,L.etal.(2013)Quantitationofpyridyloxobutyl-DNAadductsintissuesofratstreatedchronicallywith(R)-or(S)-N′-nitrosonornicotine(NNN)inacarcinogenicitystudy.Chem.Res.Toxicol.,26,1526–35.；Balbo,S.etal.(2013)(S)-N′-Nitrosonornicotine,aconstituentofsmokelesstobacco,isapowerfuloralcavitycarcinogeninrats.Carcinogenesis,34,2178–2183.；McIntee,E.J.etal.(2000)MetabolismofN′-nitrosonornicotineenantiomersbyculturedratesophagusandinvivoinrats.Chem.Res.Toxicol.,13,192–199.)。Balbo等通过老鼠喂食实验发现喝添加(S)-NNN的老鼠得口腔癌的数量比喝添加(R)-NNN的老鼠高14倍(Balbo,S.etal.(2013)(S)-N′-Nitrosonornicotine,aconstituentofsmokelesstobacco,isapowerfuloralcavitycarcinogeninrats.Carcinogenesis,34,2178–2183.)。目前还没有针对NAT和NAB手性分子有害性差异的研究。目前报道的拆分NNN的方法有两个：毛细管电泳（CE）（McCorquodale,E.M.etal.(2003)EnantiomericseparationofN′-nitrosonornicotinebycapillaryelectrophoresis.Anal.Chim.Acta,496,177–184.）和气相色谱热能分析仪（GC/TEA）（Carmella,S.G.etal.(2000)EnantiomericcompositionofN′-nitrosonornicotineandN′-nitrosoanatabineintobacco.Carcinogenesis,21,839–43.）。其中毛细管电泳的方法能够用来拆分NNN标样，但由于检测限过高作者没能检测到样品中的NNN手性分子。而气相色谱热能分析仪方法的过程比较繁琐，需要首先利用高效液相色谱（HPLC）分离和收集NNN和其它烟草特有亚硝胺，然后利用气相色谱热能分析仪分别拆分其手性分子。过于繁琐的分析过程，特别是高效液相色谱分离这一步，会导致样品损失影响样品的检出限。由于现有的拆分这两种方法都有各自的缺点，限制了这两种方法的应用，新的操作简便、检测限低的拆分烟草特有亚硝胺手性分子的分析方法有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：针对现有拆分烟草特有亚硝胺手性分子分析方法的缺陷，提供的一种操作简便的分析方法，该方法不需要利用高效液相色谱提前分离NNN和其它烟草特有亚硝胺，样品前处理和分析的总时间减少，样品在前处理过程中的损失降低，拆分效果优于目前报道的毛细管电泳和气相色谱热能分析仪分析方法。本专利技术同时拆分烟草特有亚硝胺手性分子的技术方案包括以下步骤：（1）取粉末状烟叶样品，然后添加三氯甲烷和10%的氢氧化钠溶液，振荡提取；（2）取上清的三氯甲烷，利用旋转蒸发仪蒸干，然后用缓冲溶液重溶解，并用滤纸过滤；（3）过滤后的缓冲溶液用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后重溶解在三氯甲烷中；（4）将溶解了样品的三氯甲烷添加到SEP-PAKPlus硅胶固相提取柱，然后依次添加三氯甲烷、三氯甲烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯进行洗脱柱子；（5）收集乙酸乙酯流出液，蒸干后重溶解在乙腈中，然后利用气相色谱热能分析仪分析样品中的烟草特有亚硝胺的手性组成即可，其中气相色谱热能分析仪中分析柱为两根色谱柱通过连接头连接在一起，一根为手性色谱柱，另一根为中等极性色谱柱。所述缓冲溶液由55mM的柠檬酸、904mM的磷酸氢钠和20mM的抗坏血酸维生素C混合制得，缓冲溶液的pH值为4.5，目的是通过调整pH值将需要分析的烟草亚硝胺变为游离态，便于下一步的选择性提取，达到纯化的目的。其中抗坏血酸的作用是保障游离态的烟草亚硝胺不被氧化变质。所述气相色谱热能分析仪的分析条件为：进样口温度为225℃；载气为氦气；炉子温度为60℃保持2min，然后以20℃/min速度升到187℃，然后保持10min，然后以0.5℃/min的速度升到203℃，然后以6℃/min的速度升到215℃，并保持10分钟。所述步骤（1）中烟叶样品为2克，颗粒大小低于830um，三氯甲烷为15ml，氢氧化钠为0.5ml。所述步骤（2）中缓冲溶液为4ml。所述步骤（3）中乙酸乙酯为5ml，三氯甲烷为0.5ml。所述步骤（4）中依次添加的三氯甲烷为5ml，三氯甲烷/乙酸乙酯为5ml，乙酸乙酯为10ml。所述步骤（4）中三氯甲烷/乙酸乙酯体积比例为50：50。所述步骤（1）中振荡提取时间为2h。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过将气相色谱热能分析仪中的分析柱设计成两根，其中一根为手性色谱柱，另一根为中等极性色谱柱，这样在分析时中等极性色谱柱能够起到将NNN与NAB、NAT分离开的作用，因此在实验中即可省去采用高效液相色谱分离这一实验步骤，避免由于采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时拆分烟草特有亚硝胺手性分子的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）取粉末状烟叶样品，然后添加三氯甲烷和10%的氢氧化钠溶液，振荡提取；（2）取上清的三氯甲烷，利用旋转蒸发仪蒸干，然后用缓冲溶液重溶解，并用滤纸过滤；（3）过滤后的缓冲溶液用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后重溶解在三氯甲烷中；（4）将溶解了样品的三氯甲烷添加到SEP‑PAK Plus硅胶固相提取柱，然后依次添加三氯甲烷、三氯甲烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯进行洗脱柱子；（5）收集乙酸乙酯流出液，蒸干后重溶解在乙腈中，然后利用气相色谱热能分析仪分析样品中的烟草特有亚硝胺的手性组成即可，其中气相色谱热能分析仪中分析柱为两根色谱柱通过连接头连接在一起，一根为手性色谱柱，另一根为中等极性色谱柱。

【技术特征摘要】
1.一种同时拆分烟草特有亚硝胺手性分子的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）取粉末状烟叶样品，然后添加三氯甲烷和10%的氢氧化钠溶液，振荡提取；（2）取上清的三氯甲烷，利用旋转蒸发仪蒸干，然后用缓冲溶液重溶解，并用滤纸过滤；（3）过滤后的缓冲溶液用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后重溶解在三氯甲烷中；（4）将溶解了样品的三氯甲烷添加到SEP-PAKPlus硅胶固相提取柱，然后依次添加三氯甲烷、三氯甲烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯进行洗脱柱子；（5）收集乙酸乙酯流出液，蒸干后重溶解在乙腈中，然后利用气相色谱热能分析仪分析样品中的烟草特有亚硝胺的手性组成，其中气相色谱热能分析仪中分析柱为两根色谱柱通过连接头连接在一起，一根为手性色谱柱，另一根为中等极性色谱柱；所述缓冲溶液由55mM的柠檬酸、904mM的磷酸氢钠和20mM的抗坏血酸维生素C混合制得，缓冲溶液的pH值为4.5；所述气相色谱热能分析仪的分析条件为：进样口温度为225℃；载气为氦气；炉子温度为60℃保持2min，然后以20℃/min速度升到187℃，然后保持10...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡斌，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州;52