本发明专利技术涉及一种包含启动子的分离的核酸序列，其是一种包含SEQ ID 1所示的pCS1的核酸序列或其有功能活性的变种的天然毕赤酵母序列，该变种是一种长度变种，一种突变体或SEQ ID 1的杂合序列，或其结合，涉及包含所述启动子的表达构建物和重组细胞，还涉及在所述启动子的控制下产生感兴趣的蛋白质的方法。本发明专利技术进一步涉及一种从真核细胞中识别组成型启动子的方法，和一种包含启动子的分离的核酸序列，该启动子在与编码POI的核苷酸序列可操作的连接时，指导其在宿主细胞中的表达水平高于在高和低生长速率的天然pGAP启动子控制下的表达水平。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及一种包含强组成型启动子的分离的核酸序列和一种在该启动子控制 下的在真核细胞培养基中生产感兴趣的蛋白的方法。
技术介绍
已采用真核宿主成功生产了重组蛋白。最著名的例子是酵母，如啤酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母（Pichiapastoris)或多形汉逊酵母（Hansenula polymo;rpha)，丝状真菌（filamentousfungi),如泡盛曲霉（Aspergillusawamori)或里氏 木霉灯richodermareesei)，或哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞（C册）细胞。尽管某 些蛋白已经实现高速率生产，许多其他蛋白质只能W比较低的产量获得。 基因在宿主生物中的异源表达需要一种可实现宿主细胞的稳定转化的载体。该载 体将提供具有紧邻编码序列5'端的功能启动子的基因。从而该启动子序列调节和启动转 录。目前所用的大多数启动子来源于编码通常在细胞中W高浓度存在的蛋白的基因。EP0103409A2公开了和糖酵解途径中的特定酶的表达相关的酵母启动子的使用， 例如设及丙酬酸激酶、憐酸丙糖异构酶、憐酸葡萄糖异构酶、憐酸甘油酸变位酶、己糖激酶1 和2、葡糖激酶、憐酸果糖激酶、醒缩酶和糖酵解调苄基因的启动子。 WO97/44470描述了源自解脂耶氏酵母（Yarrowialipoidica)的转录延伸 因子I(TEFl)蛋白和适合在酵母中表达异源蛋白的核糖体蛋白S7的酵母启动子，并且 EP1951877A1描述了生产异源蛋白的毕赤酵母（P.pastoris)TEFl启动子的使用。W02005003310提供了在使用从产油酵母（oleaginousyeast)解脂耶氏酵母 (Yarrowialipoidica)的甘油醒-3-憐酸脱氨酶或憐酸甘油变位酶启动子在酵母中表达 感兴趣的编码序列的方法。 源自设及毕赤酵母（Pichiapastoris)甲醇代谢途径基因的启动子序列已经公开 于US4808537 和US485523U醇氧化酶A0XUA0X2)和US6730499B1 (甲醒脱氨酶FLDl)中。 US20080153126A1包括基于AOXl启动子的突变体启动子序列。 AOXl启动子仅受甲醇诱导，并受到其他碳源例如葡萄糖或乙醇的阻遏。甲醇的弊 端是因为可能具有毒性和易燃性，不适合用于生产某些产品。因此，我们试图寻找AOXl启 动子的替代物。Vassileva等人（J.Biotechnol. (2001)88:21-35)描述了使用多拷贝表达盒作为 AOXl启动子的替代物，在毕赤酵母中使用GAP启动子表达乙型肝炎病毒表面抗原（皿sAg)。 提出了维持细胞在对数中期的连续培养的构成体系。毕赤酵母中使用的启动子或者受到严格调控（像pAOX或pFLD)，对特定底物例如 甲醇有活性，或者在许多不同的条件，培养基和底物中具有组成型活性。已经报道，在运些 组成型启动子中，特别是GAP和TEF启动子对于重组蛋白的产生具有强的和有用的启动作 用。 但是，结果表明两种组成型启动子在分批补料生产过程中不是一直强启动的。特 别是在在该过程的后期，当细胞生长率低时，该启动子活性也降低，因此限制了感兴趣的基 因（GOI)的表达和生产量（Stadlmayr等人，2010.JBiotechnol. 150:519-529)。因为即使是高丰度的糖酵解酶例如締醇酶巧NO)，憐酸丙糖异构酶（TPI)或葡萄 糖6-憐酸异构酶（PGI)都没有如pGAP和pTEF-样强的启动子，因此选择合适的启动子 不是凭直觉而是理性的。（Stadlmayr等人 2010.JBiotechnol. 150:519-529;Gasser等 人.2010.Met油olic!Engineering12:573-580).Qin等人（Appliedand!EnvironmentalMicrobiology(2011) 3600-3608)报道了 GAP启动子库和各种具有不同活性的启动子。W02007/015178A2报道了能够诱导重组蛋白分泌生产的转录融合伴侣和毕赤酵母 cDNA库。CN102180954A报道了采用毕赤酵母细胞壁蛋白GCW14作为错定蛋白的细胞表面 显不系统。 需要的是提供改善的重组真核细胞系来生产可高产量分离的发酵产品。因此，本 专利技术的目的是提供适合重组生产方法的可选择的调节元件，该调节元件是简单和高效的。
技术实现思路
通过权利要求的主题解决了本专利技术的目标。 本专利技术提供了一种包含启动子的分离核酸序列，该启动子是一种天然的毕赤酵母 序列，包含SEQID1所示的PCSl核酸序列或由该序列组成，或者其有功能活性的变种，它 是一种长度变种，一种突变体或与其结合。 根据一个特定方面，本专利技术提供了一种包含一种启动子的分离核酸序列，该启动 子是一种天然的毕赤酵母序列，包含SEQID1所示的PCSl核酸序列或由该序列组成，或是 一种其有功能活性的变种，该有功能活性的变种是一种长度变种，一种SEQID1的突变体 或杂合序列，或其结合，其中，所述有功能活性的变种表现与pCSl，特别是SEQID1所示的 pCSl核酸序列实质相同的活性。 特别地，所述pCSl核酸序列与所述SEQID1的序列相同。 优选地，所述本专利技术的核酸序列与W02007/015178A2的列表中的SEQID87(即， 本申请的SEQID24)的核酸序列不相同。 特别地，所述有功能活性的变种是a) -种沈QID1所示的pCSl的长度变种，优选包含选自由沈QID2、3、4、5、6、7 和8组成的组的核酸序列或由该核酸序列组成；b) -种SEQID1所示的pCSl的突变体，或一种a)的长度变种的突变体，其突变 体具有与所述序列SEQID1或所述长度变种至少60 %的同源性；[00幼 C) 一种杂合序列，包含 -一一种选自由序列为SEQID1所示的pCSl、一种a)的长度变种和一种b)的突 变体组成的组的序列；和 -一至少一种选自由SEQID1所示的pCSl、一种a)的长度变种、一种b)的突变 体和一种异源序列组成的组的进一步的序列；或d) -种序列，所述序列在严谨条件下与任何长度变种杂交，或者与a)或b)的突变 体核酸序列杂交。 优选地，所述沈QID1所示的pCSl的长度变种由沈QID2、沈QID3、沈QID4、 沈QID5或沈QID6中任一项组成。 根据一特别实施方式，所述有功能活性的变种选自由和下列序列同源的序列组成 的组：i)至少约60%的核巧酸序列一致性； ii)通过修饰所述SEQID1所示的pCSl的核巧酸序列或其长度变种获得的同源 序列，或者通过插入、删除或替换所述序列内的或者一个或两个末端的一个或多个核巧酸 获得的同源序列，优选地，具有SObp~1500bp，或200bp~ISOObp的核巧酸序列，更优选 地，具有至少2(K)bp的核巧酸序列；和 iii)源自毕赤酵母W外的种的类似物。 特别地，本专利技术的有功能活性的变种具有与pCSl实质相同的启动子活性。 根据一特别实施方式，所述核酸序列与编码POI的核巧酸序列操作性连接，该核 酸与编码POI的核巧酸序列并非天然相关的。 根据一特别方面，所述核酸序列进一步包含实现PO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的核酸序列，包含启动子，所述启动子是包含SEQ ID 1所示的pCS1核酸序列的毕赤酵母的天然序列，或者是具有其功能活性的变种，所述变种是长度变种，突变体或SEQ ID 1的杂交产物，或其组合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·马塔诺维赫，B·加塞尔，R·普里尔霍弗，
申请(专利权)人：龙沙有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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