一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法技术

本发明专利技术属于鱼类育种技术领域，本发明专利技术公开了一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法。所述线纹海马微卫星标记如SEQ.ID.NO:1~9中所示，所述微卫星标记的筛选方法，步骤包括：1）通过转录组测序筛选到线纹海马的Unigenes；2）在Unigenes序列中检测微卫星位点；3）根据微卫星位点两端序列设计其特异性引物；4）进行PCR扩增并检测其多态性，获得了9个微卫星标记。本发明专利技术首次公开了关于线纹海马的微卫星标记及其特异性引物，本发明专利技术中的线纹海马微卫星标记可应用于线纹海马种群的种群遗传结构、遗传育种、亲子鉴定等研究。

【技术实现步骤摘要】
一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法
：本专利技术属于微卫星标记
，具体涉及一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法。
技术介绍
：海马，属海龙科(Syngthidae)、海马属(Hippocampus)，是一种名贵海洋中药材，在我国素有“南方人参”之称，具有补肾壮阳、强心催产、止血镇痛、镇静安神的功效，同时还具有很高的观赏价值和收藏装饰品的功能。在过去几十年中，由于长期过度捕捞、环境污染和气候变化等因素，海马种质资源受到严重退化的威胁，有些海马种甚至到了灭绝的边缘。为了有效保护海马的种质资源，38种海马被列入《世界自然保护联盟》(IUCN)2012年濒危动物红色名录。因此，研究其种群遗传结构和遗传变异水平至关重要。线纹海马(HippocampuserectusPerry，1810)主要分布在大西洋西岸，是典型的热带亚热带型海马种群，其繁殖力强、个体较大、体型优美，其生长速率最快，目前已经发展为我国主要的养殖品种之一。微卫星标记因具有多态性丰富、共显性、操作简便等优点，已经成为目前动植物群体遗传分析、遗传背景分析、家系鉴定和野生资源保护等最常用的工具之一。然而，迄今为止针对线纹海马开发的微卫星标记尚未有记载，亟待开发。另一方面，目前微卫星开发主要采用富集文库法，需要进行DNA提取、基因组文库构建、探针杂交富集、克隆筛选等步骤，费时费力，通常只能得到少量标记。因此急需一种高效的线纹海马微卫星标记开发技术。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题在于针对现有线纹海马分子标记缺乏而提供一种微卫星标记及其筛选方法。本专利技术的技术目的通过以下技术方案实现：本专利技术首次公开了一种线纹海马微卫星标记，所述微卫星标记序列如SEQ.ID.NO:1～9中所示。本专利技术还提供了特异性扩增所述的线纹海马微卫星标记的引物，所述引物为SEQ.ID.NO：10+SEQ.ID.NO：11、SEQ.ID.NO：12+SEQ.ID.NO：13、SEQ.ID.NO：14+SEQ.ID.NO：15、SEQ.ID.NO：16+SEQ.ID.NO：17、SEQ.ID.NO：18+SEQ.ID.NO：19、SEQ.ID.NO：20+SEQ.ID.NO：21、SEQ.ID.NO：22+SEQ.ID.NO：23、SEQ.ID.NO：24+SEQ.ID.NO：25和SEQ.ID.NO：26+SEQ.ID.NO：27。进一步地，本专利技术提供所述的线纹海马微卫星标记的筛选方法，所述方法步骤如下：S1.提取线纹海马样品的总RNA，合成cDNA、将cDNA文库进行均一化处理，建立测序文库；S2.采用IlluminaHiSeqTM2000测序，获得线纹海马原始序列；S3.将步骤S2中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，对其进行从头组装得到线纹海马的Unigenes；S4.对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查找；S5.根据步骤S4中微卫星位点的两端序列设计特异性引物；S6.提取线纹海马基因组DNA；S7.采用步骤S5中的特异性引物对步骤S6中的DNA进行PCR扩增；S8.检测步骤S7中PCR产物的多态性，获得权利要求1所述的线纹海马微卫星标记。本专利技术所述的构建方法高效、简便，能一次开发较多线纹海马微卫星标记。优选地，利用TRIzol法对步骤S2中线纹海马的鳍条进行RNA提取。优选地，步骤S3中采用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到117327个线纹海马的Unigenes。优选地，步骤S4中用MISA软件对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查找。用MISA软件在Unigenes序列中进行微卫星位点的查找，得到39848个含有微卫星位点的序列，微卫星位点查找时重复次数为5～64，其中22582个单核苷酸重复序列，9311个二核苷酸重复序列，7218个三核苷酸重复序列，645个四核苷酸重复序列，59个五核苷酸重复序列，33个六核苷酸重复序列。在已获得的微卫星位点中随机选取，根据其两端序列，利用Primer5软件设计微卫星位点的特异性引物，其中，筛选得到的具有扩增稳定、PCR产物杂带少的引物如表2所示；优选地，步骤S6中线纹海马的DNA利用醋酸铵/异戊醇法对其鳍条进行提取。优选地，以DNA为模板，利用设计好的引物进行微卫星标记PCR扩增。步骤S7中的PCR扩增的反应体系为10μL，包括：50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1UTaq酶，dNTPs0.2mM，正反引物均为0.25μM。优选地，步骤S7中的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(不同位点设计的特异性引物具有不同的最佳退火温度)，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。优选地，步骤S8中的微卫星PCR产物的多态性利用8％的非变性的聚丙烯凝胶电泳进行验证。表1.本专利技术具有特异性的线纹海马微卫星引物序列信息与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术首次在线纹海马上建立了具有丰富多态性的微卫星标记，且对线纹海马的家系鉴定准确率高达97％以上，为线纹海马的种群遗传结构、遗传育种、亲子鉴定等研究提供了强有力的工具；2、本专利技术所使用的开发微卫星标记的方法，简便、快捷、高效，节约了人力和成本。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，但不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本专利技术的内容作出一些非本质的改进和调整。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。实施例1、线纹海马微卫星位点和特异性引物的获得和验证：线纹海马样品收集及RNA提取：从海马养殖公司中挑选30条健康、性腺发育良好的海马，剪取其背鳍鳍条，立即提取totalRNA，具体步骤如下：(1)将线纹海马的鳍条约50mg放入预冷的研钵中，利用液氮迅速研磨成粉末，放入2mL离心管中，并加入1mLTRIzol；(2)离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静止3min，待溶液分层；(3)4℃，12,000r/min离心15min，吸取上清放入新的离心管中；(4)加入与上清等体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置5-10min；(5)4℃，12,000r/min离心10min，弃去上清，短暂离心，吸去剩余异丙醇；(6)加入1mL75％的乙醇，充分洗涤沉淀，4℃，7,500r/min离心5min，短暂离心，吸去剩余乙醇，重复一次该步骤；(7)室温晾干乙醇，加入20μLDEPC处理水使RNA充分溶解，-80℃保存备用；(8)取1uL左右的样品进行电泳检测RNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测RNA浓度和质量。线纹海马转录组的测序、拼接及组装并查找微卫星位点：应用SMARTTMcDNA文库构建技术，对RNA样品进行cDNA的双链合成，用Trimmer-directcDNAnormalizationkit对全长cDNA进行均一化处理。采用IlluminaHiSeqTM2000进行测序，获得原始序列。去除原始序列的接头和低质量序列，获得高质量序列，采用Trinity软件对其进行从头组装，得到1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种线纹海马微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记序列如SEQ.ID.NO:1~9中所示。

【技术特征摘要】
1.一种线纹海马微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记序列如SEQ.ID.NO:1~9中所示。2.一种特异性扩增如权利要求1所述的线纹海马微卫星标记的引物，其特征在于，所述引物为SEQ.ID.NO：10+SEQ.ID.NO：11、SEQ.ID.NO：12+SEQ.ID.NO：13、SEQ.ID.NO：14+SEQ.ID....

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伟，林强，屈宏越，王信，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44