一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX2及其编码基因与应用制造技术

一个来源于小盐芥的液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX2及其编码基因，以及其在培育耐盐提高的转基因植物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种小盐芥液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX2及其编码基因与应用
本专利技术涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于小盐芥的液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX2及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。
技术介绍
盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约0.4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3％以下的土壤上，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展(ZhuJK.2002.Saltanddroughtstresssingaltransductioninplants.Annu.Rev.PlantBiol.53：1247-1273；ZhangZL.2011.ArabidopsisFloralInitiatorSKB1ConfersHighSaltTolerancebyRegulatingTranscriptionandPre-mRNASplicingthroughAlteringHistoneH4R3andSmallNuclearRibonucleoproteinLSM4Methylation.PlantCell，23：396-411)。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。
技术实现思路
本专利技术人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白(本文命名为NHX2)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株后，可明显改善转基因植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。本专利技术第一方面提供小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白NHX2的编码基因(本文命名为ThNHX2)，其序列为SEQIDNO：2。本专利技术第二方面提供一种重组表达载体，其含有本专利技术第一方面所述的基因，其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的，优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述重组表达载体为附图2所示的35S-ThNHX2-2300载体。本专利技术第三方面提供一种重组细胞，其含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本专利技术第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的基因、本专利技术第二方面所述的重组表达载体或者本专利技术第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第七方面提供由本专利技术第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附图说明图1是NHX2基因的植物表达载体(35S-ThNHX2-2300)构建流程(图1a-1b)。图2是NHX2基因的植物表达载体(35S-ThNHX2-2300)的质粒图。图3是培养的供试植物拟南芥。图4是ThNHX2转基因拟南芥的T1代植株的耐盐实验结果，T1c4表现出明显的耐盐性，T1c17、T1c19的结果与其类似，在此未示出。图5为利用反转录PCR对T1代转基因烟草植株和非转基因对照植株中ThNHX2基因的转录水平进行分子水平检测的结果。M为DNALadderMarker(DL2000)，1-4为不耐盐的对照拟南芥植株，13为质粒PCR阳性对照(35S-ThNHX2-2300质粒)，5-12为耐盐T1代转基因拟南芥植株。具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本专利技术。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本专利技术的范围。下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自NewEnglandBiolabs公司。实施例1.盐胁迫下小盐芥SSH文库构建：具体方法为：按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建SSH文库(差减文库)。在实验过程中以生长过程中盐处理的小盐芥组织中提取的mRNA作为样本(Tester)，以未处理的小盐芥组织中提取的mRNA作为对照(Driver)。具体步骤如下：(1)供试材料：小盐芥(Thellungiellahalophila，购自中国内蒙古巴彦淖尔市乌兰布和沙漠绿色植物园盐生植物繁育中心)播种到灭菌的蛭石上，在22℃、光周期12小时光照/12小时黑暗(光强3000-4000Lx)条件下培养，每周浇1/2MS培养基(含有9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。当植株长到直径达为5-6cm时用于实验。(2)材料处理：将供试植株分为2组，每组4盆，每盆3株。第一组为对照组，正常地用1/2MS浇灌；第二组为盐处理组，浇灌300mMNaCl溶液，将两组植物在22℃、光周期12小时光照/12小时黑暗(光强3000-4000Lx)条件下培养处理10天，然后及时收集两组植株(用蒸馏水洗净根部)，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。(3)总RNA提取：分别取对照组和盐处理组的小盐芥3.0g，用植物RNA提取试剂盒(购自invitrogen)提取总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定所得总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.小盐芥的一个液泡膜钠氢反向转运蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.编码权利要求1的液泡膜钠氢反向转运蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，所述表达载体是pCAMBIA2300。4.一种重组细胞，其含有权利要求3的重组表达载体；所述重组细胞为...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔洪志，梁远金，田大翠，刘捷，
申请(专利权)人：创世纪种业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44