一种铬‑白蛋白螯合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种铬‑白蛋白螯合物及其制备方法和应用，该铬‑白蛋白螯合物是铬离子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。本发明专利技术建立了铬‑白蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测铬‑白蛋白螯合物在评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬‑白蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程度。本发明专利技术建立的铬‑白蛋白螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测领域，更具体地说，涉及一种铬-白蛋白螯合物及其制备方法和 应用。
技术介绍
血清白蛋白（HSA)是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众 多的内源性和外源性物质，这与它特异性结构密切相关。血清白蛋白是由肝脏合成的一种 简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。根据数据资料显示，牛血清白 蛋白（BSA)分子由583个氨基酸残基组成。而人血清白蛋白（HSA)比BSA多2个氨基酸， 即585个氨基酸残基组成。两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的残 基。白蛋白氨基酸成分最显著的特征是低含量的色氨酸，HSA和BSA每分子中分别含有1或 2个残基。苯丙氨酸和异亮氨酸含量也比较低。半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量都 非常高。大量的离子化残基提供了白蛋白非常高的电荷，在PH7的条件下，每分子白蛋白带 有185个离子，这样就形成白蛋白易溶性。 白蛋白最独特的结构特点是二硫键模式。BSA序列包含35个半胱氨酸残基，形成 17个二硫桥，相邻的半胱氨酸对与链上最近的残基连结，形成10-47个残基长度的一对环。 S-S键交迭增加了白蛋白结构的刚性和稳定性。 白蛋白的三级结构被认为是一种高度螺旋的分子，通过X射线衍射得知HCR晶体 中大约67%的残基参与形成了 28个a-螺旋体，10%残基参与形成0转角，23%残基形 成伸展链。 生理机制上，白蛋白维持人体血浆胶体渗透压的80 %。另外，白蛋白也是血液中各 种大分子物质的主要载体，在代谢物转运、生物转化中发挥着重要作用。它同时也是调节凝 血功能和炎性反应的组分。人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究。 络（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有 光泽，有较高的熔点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪以来被广泛应用，每年 全球铬生产量高达107吨，因而铬是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铬广泛应用于 电镀、鞣革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人 类的身体健康产生巨大影响。在美国，Cr与Cr、Cd、Pb被称为四大环境污染物。据统计，每 年有几十个亿的民众都在饮用铬污染的水源，而在加利福利亚有高达30%的水资源都已经 被铬污染，因而铬污染严重影响着人们的身体健康。自然界中铬主要以三价和六价的形式存在，而一般认为，三价铬（Cr3+)是人类所 需的微量元素，而六价铬（Cr6+)才是明显的毒性物质。由于六价铬易通过细胞膜进入细胞， 而且可以通过一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铬的毒性 高于三价铬，达10-100倍。学者认为当水中的六价铬含量超过〇.〇5mg/L即是有毒的。六 价铬可以通过皮肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性 暴露人群主要是通过呼吸道吸入六价铬灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式摄入六价铬。六价铬进入体内后，可以引发氧化应激、染色体 畸变、细胞凋亡、多种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联、Cr-DNA 配合物形成等），从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。不仅如此，六价铬还被认为是一 种强有力的致癌物，早在1990年国际癌症研究组织。 铬与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对铬毒性研究的深入，人们逐渐认识到铬与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解铬的毒性机理的关键所在，因此，对铬和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于铬与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铬之 间的关系还不清楚，因而加强对于铬与蛋白质之间的关系至关重要。
技术实现思路
针对铬污染严重的问题，本专利技术的目的在于提供一种铬-白蛋白螯合物及其制备 方法，并建立铬-白蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铬-白蛋白螯合物在 评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬-白蛋白螯合物可 以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程度。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铬-白蛋白螯合物，铬离 子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。 本专利技术还提供一种上述的铬-白蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤： A)铬与白蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的白蛋白或按照生物学方法重组的 白蛋白中加入铬离子进行螯合反应，得到反应溶液； B)纯化铬_白蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应 的白蛋白以及多余的铬离子，即得铬-白蛋白螯合物。 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下： (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铬-白蛋白螯合 物复溶； (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与白蛋 白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱； (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，白蛋白 与填料特异性结合； (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I; (5)收集：收集洗脱液I; (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本； (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱； (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱； (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II; (10)收集：收集洗脱液II; (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三 次后，4 °C透析过夜，收集样本，即得铬-白蛋白螯合物。 其中，上述铬-白蛋白螯合物的制备方法，还包括步骤C):对铬-白蛋白螯合物的 鉴定； 其中，步骤C)中具体如下： (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床； (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-白蛋白螯合物，加入稀释缓冲液，并混 匀，然后加样于样品槽中； (3)电泳：连接电泳板，进行电泳； (4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有铬以及检测铬的含量。 本专利技术还提供一种如上述的铬-白蛋白螯合物在制备检测人体内铬-白蛋白螯合 物的试剂或试剂盒中的应用。 本专利技术还提供一种至少包括如上述的铬-白蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获白蛋白的物质或捕获铬的 物质。 本专利技术还提供一种定量检测铬-白蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的 铬-白蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫 与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铬‑白蛋白螯合物，其特征在于，铬离子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张积仁，阳帆，董欣敏，吴婧，蔡睿，孙遥，赵乙木，
申请(专利权)人：上海拜豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31