一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂；2）制备卷烟烟气总粒相物；3）细胞接种培养；4）卷烟烟气总粒相物染毒；5）样品处理及GSH/GSSG测定；6）结果分析。本发明专利技术应用SBB缓冲液重悬细胞，防止人为的氧化GSH，同时增加了样品的有效处理时间；考虑到细胞裂解液中存在活性巯基的蛋白质，为了减少非谷胱甘肽的硫化物与DTNB结合而干扰检测，在样品测定前，加入5-磺基水杨酸用于脱去样品中蛋白质，减少了测定过程中的干扰；由于本方法同时检测GSH和GSSG，在结果处理时应用了差减法，可分别得到GSH和GSSG浓度，本发明专利技术具有耗时短，操作简便，灵敏度高，结果可靠的优点。
【技术实现步骤摘要】
卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法
本专利技术涉及到卷烟烟气总粒相物的体外毒理学研究，具体来说是一种检测卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化损伤后胞内谷胱甘肽还原态与氧化态比值（GSH/GSSG）的测定方法。
技术介绍
卷烟烟气是一种复杂的混合物，已报道的化学成分超过8000种，并且部分化学成分显示出一定的氧化性。当细胞或组织暴露在卷烟烟气中时，细胞体系的氧化/抗氧化平衡被打破，细胞产生氧化应激，并最终导致机体产生病理性损伤。当细胞发生氧化应激时，细胞内活性氧族（ROS）以及活性氮族（RON）增加，会对脂质、蛋白质以及DNA等产生不同程度的氧化损伤，同时激活细胞内抗氧化物质如细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD），还原型谷胱甘肽（GSH），过氧化氢酶等。在这些抗氧化物中，GSH在细胞内发挥重要的抗氧化作用。GSH是细胞内含量丰富的硫醇式缩氨酸，对维持细胞氧化还原平衡发挥重要作用，被广泛作为细胞氧化应激标志物。针对细胞氧化应激状态下胞内GSH/GSSG的检测，用荧光测定法较易于操作，但检测结果易受干扰；而采用高效液相色谱法分析时，样品前处理过程耗时长，并且对于大样品的检测不方便，所用的柱子也较特殊。当前，较常用的检测方法是酶循环法，该方法最初由Owen和Belcher提出（OwensCW,BelcherRV.Acolorimetricmicro-methodforthedeterminationofglutathione.BiochemJ.1965;94:705-711），之后由Tietze（TietzeF.Enzymicmethodforquantitativedeterminationofnanogramamountsoftotalandoxidizedglutathione:applicationstomammalianbloodandothertissues.AnalBiochem.1969;27(3):502-522.）和Griffith（GriffithOW.Determinationofglutathioneandglutathionedisulfideusingglutathionereductaseand2-vinylpyridine.AnalBiochem.1980;106(1):207-212.）进行了改进。但该方法仍然存在一些不足之处：首先，其特异性不够高，主要是由于5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）可与许多含活性巯基基团的物质反应，同时，检测的是谷胱甘肽总量，不能区分出GSH和GSSG；此外，该方法对样品的处理时间要求严格，从开始准备样品到检测，时间不能超过3分钟,否则将影响测定结果。
技术实现思路
本专利技术的目的正是针对上述存在的问题对部分操作步骤进行了改进，基于酶循环法建立一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激时胞内GSH/GSSG的检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，包括以下工艺步骤：1)配制实验试剂：包括（1）生长培养液，（2）磷酸缓冲盐溶液（PBS），（3）1%的胰酶，（4）三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB），（5）掩蔽剂，（6）脱蛋白质剂，（7）GSSG标准溶液，（8）反应混合液，（9）还原型辅酶Ⅱ（NADPH）溶液，（10）阴性对照；２）制备卷烟烟气总粒相物：将捕集有卷烟烟气总粒相物的剑桥滤片直接放入锥形瓶中，加入适量体积的DMSO，萃取捕集在剑桥滤片上的主流烟气粒相组分，室温振荡20min，去滤片过滤除菌，制备烟气总粒相物浓度为10mg/ml的样品储存液，于-80℃保存。３）细胞接种培养：细胞进行消化以后，制备细胞悬液，6孔板的所有孔中每孔加入2.0mL生长培养液+450μL细胞悬液，于37℃、5%CO2条件下培养24h；４）卷烟烟气总粒相物染毒：用生长培养液将卷烟烟气总粒相物储存液调整到不同浓度，终浓度设置至少包括2个非零浓度，使细胞存活率在70%以上，培养24h后的细胞，吸去培养液，6孔板中阴性对照组每孔加入2.5mL20μg/mLDMSO生长培养液，实验组每孔加入2.5mL含有不同浓度卷烟烟气总粒相物的生长培养液，于37℃、5%CO2条件下培养24h；５）样品处理及GSH/GSSG测定：细胞孵育24h后，吸去培养液，每孔加入1mL37℃预热的PBS洗一次,经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5mL离心管中重悬于500μLSBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞（功率300W，3~5秒/次，间隔10秒，重复3~5次），10000g、4℃下离心10min，收集上清液，加入5%（v/v）5-磺基水杨酸，混均，取50μL加入1.5mL离心管，并加入50μLPBS稀释，制得检测样品；取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50μL,加入相应孔内，空白孔加入50μLPBS缓冲液；其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂1μL/孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂。孵化1min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150μL反应混合液，孵化2min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50μL；立即在412nm下测定吸光值OD，每30s记录一次OD值，记录3min；６）结果分析：（1）原始吸光值OD0，反应t时间时检测的吸光值ODt；（2）反应t时间内吸光值的变化值ΔODt：ΔODt=ODt-OD0；（3）所有检测孔内由相应的ΔODt做关于时间t的一次函数，其中斜率为该孔检测浓度下的ΔOD/min；（4）所有检测孔的ΔOD/min，经空白对照ΔOD/min(空白)校正为ΔOD/min(校正)：ΔOD/min(校正)=ΔOD/min—ΔOD/min(空白)ΔOD1/min：GSH(总)检测孔的ΔOD/min(校正)ΔOD2/min：GSSG检测孔的ΔOD/min(校正)（5）以GSSG标准样品的ΔOD/min(校正)和浓度，拟合标准曲线y=Ax+B（6）样品中GSH/GSSG为：各实验试剂的配制方法如下：(1)生长培养液：RPMI-1640，10%胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素；(2)磷酸缓冲盐溶液（PBS）：0.2gKCl，0.2gKH2PO4，8gNaCl，2.9gNa2HPO4·12H2O，加双蒸水至1L，pH7.2~7.4，高压灭菌；(3)1%的胰酶：1g胰酶定容至100mLPBS中（冰浴下搅拌3h~4h），滤膜过滤，分装到10mL离心管，于-20℃冻存；(4)三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB）：其中含有：100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10mM硼酸盐，5mM丝氨酸，1mM二乙烯三胺五乙酸，PH7.0；(5)掩蔽剂：v/v25%的2-乙烯基吡啶无水乙醇溶液；(6)脱蛋白质剂：5-磺基水杨酸；(7)GSSG标准溶液：12.5μM的GSSG标准液用PBS逐级2倍稀释至0.195μM；(8)反应混合液（现用现配）：由以下三种溶液定量混合而成：15mMDTNB(5,5'-二硫代双2-硝基苯甲酸)300μL，5U/mL谷胱甘肽还原酶200μL，4.0mLPBS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：配制实验试剂：（1）生长培养液，（2）磷酸缓冲盐溶液（PBS），（3）1 %的胰酶，（4）三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB），（5）掩蔽剂，（6）脱蛋白质剂，（7）GSSG标准溶液，（8）反应混合液，（9）还原型辅酶Ⅱ（NADPH）溶液，（10）阴性对照；制备卷烟烟气总粒相物；细胞接种培养；卷烟烟气总粒相物染毒；样品处理及GSH/GSSG测定：细胞孵育24 h后，吸去培养液，每孔加入1 mL 37℃预热的PBS洗一次, 经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5 mL离心管中重悬于500 μL SBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞，功率300 W， 3 ~5秒/次，间隔10秒，重复3~5次；10000 g、4 ℃下离心10 min，收集上清液，加入v/v 5 %的5‑磺基水杨酸，混均，取50 μL加入1.5 mL离心管，并加入50 μL PBS 稀释，制得检测样品；取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50 μL, 加入相应孔内，空白孔加入50 μL PBS缓冲液；其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂1 μL /孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂；孵化1 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150 μL反应混合液，孵化2 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50 μL；立即在412 nm下测定吸光值OD，每30 s记录一次OD值，记录3 min；结果分析：原始吸光值OD0，反应t时间时检测的吸光值ODt；反应t时间内吸光值的变化值ΔODt：ΔODt=ODt‑ OD0；所有检测孔内由相应的ΔODt做关于时间t的一次函数，其中斜率为该孔检测浓度下的ΔOD/min；所有检测孔的ΔOD/min，经空白对照ΔOD/min(空白)校正为ΔOD/min(校正)：ΔOD/min(校正)=ΔOD/min—ΔOD/min(空白)ΔOD1/min： GSH(总)检测孔的ΔOD/min(校正)ΔOD2/min： GSSG检测孔的ΔOD/min(校正)以GSSG标准样品的ΔOD/min(校正)和浓度，拟合标准曲线y = Ax + B样品中GSH/GSSG为： 。...
【技术特征摘要】
1.一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：1）配制实验试剂，各实验试剂的配制方法如下：(1)生长培养液：RPMI-1640，10%胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素；(2)磷酸缓冲盐溶液（PBS）：0.2gKCl，0.2gKH2PO4，8gNaCl，2.9gNa2HPO4·12H2O，加双蒸水至1L，pH7.2~7.4，高压灭菌；(3)1%的胰酶：1g胰酶定容至100mLPBS中，冰浴下搅拌3h~4h，滤膜过滤，分装到10mL离心管，于-20℃冻存；(4)三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB）：其中含有：100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10mM硼酸盐，5mM丝氨酸，1mM二乙烯三胺五乙酸，PH7.0；(5)掩蔽剂：v/v25%的2-乙烯基吡啶无水乙醇溶液；(6)脱蛋白质剂：5-磺基水杨酸；(7)GSSG标准溶液：12.5μM的GSSG标准液用PBS逐级2倍稀释至0.195μM；(8)反应混合液：由以下三种溶液定量混合而成：15mMDTNB300μL，5U/mL谷胱甘肽还原酶200μL，4.0mLPBS缓冲液；(9)还原型辅酶Ⅱ(NADPH）溶液:10mLPBS溶解100mg的NADPH，使用时稀释至2mg/mL；(10)阴性对照：v/v2%二甲基亚砜（DMSO）；2）制备卷烟烟气总粒相物；3）细胞接种培养；4）卷烟烟气总粒相物染毒：用生长培养液将卷烟烟气总粒相物储存液调整到不同浓度，终浓度设置至少包括2个非零浓度，使细胞存活率在70%以上，培养24h后的细胞，吸去培养液，6孔板中阴性对照组每孔加入2.5mL20μg/mLDMSO生长培养液，实验组每孔加入2.5mL含有不同浓度卷烟烟气总粒相物的生长培养液，于37℃、5%CO2条件下培养24h；5）样品处理及GSH/GSSG测定：细胞孵育24h后，吸去培养液，每孔加入1mL37℃预热的PBS洗一次,经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5mL离心管中重悬于500μLSBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞，功率300W，3~5秒/次，间隔10秒，重复3~5次；10000g、4℃下离心10min，收集上清液，加入v/v5%的5-磺基水杨...
【专利技术属性】
技术研发人员：李翔，张世敏，谢复炜，赵俊伟，尚平平，康彧，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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