微小RNA的液态芯片恒温检测方法技术

本发明专利技术公开了一种微小RNA靶分子的液态芯片恒温指数扩增与检测方法。本发明专利技术通过将上游和/或下游引物固定在编码微球的表面，并在其表面固定的引物缺口剂识别序列两侧标记具有荧光共振能量转移作用的荧光报告分子和淬灭分子，最终编码微球表面的靶分子特异性可检测荧光信号实现多种靶分子的高通量检测。本发明专利技术克服了miRNA固有属性对其扩增检测方法的设计难度，提供一种基于寡核苷酸引物的液大态恒温指数扩增与检测系统，能够在恒定温度条件实现多种靶分子恒温指数扩增和绝对定量的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生命科学和生物
，是一种通过液态芯片恒温指数扩增的方式定性和定量检测多种微小RNA(microRNA，miRNA)的液态芯片恒温检测方法。
技术介绍
与基因组DNA、mRNA和长片段非编码RNA (IncRNA)等核酸分子相比较，微小RNA(microRNA, miRNA)分子具有其特殊性，如:核酸分子片段极小(< 22nt)，GC含量分布广泛(5?95% )，导致恪解温度(melting temperature, Tm)差异大，难于设计匹配的扩增引物和检测探针；所占总RNA的比例极低(< 0.01% )，需要高灵敏度的检测方法；家族分子差异小(可仅有单碱基差异)，对检测特异性的要求高；不同miRNA的表达水平差异极大(可达4个数量级；如:几十个拷贝/细胞至5 X 15拷贝/细胞)，要求检测线性范围宽，同时能够有效识别低丰度miRNA ;革[1序列同时存在于pr1-miRNA和pre-miRNA中；缺乏类似于mRNA的poly(A)尾，使其难以用常规技术手段进行逆转录检测。miRNA的上述特征对其核酸分子检测技术和方法提出了近乎于苛刻的特殊需求。例如，极小的分子片段使常规PCR引物设计策略无法实施，单碱基差异对引物或探针的碱基分辩能力要求极高，GC含量的巨大差异导致引物和探针难于取向于均一的退火温度。自1993年首次发现miRNA以来，miRNA的检测方法从Northern Blot探针杂交法逐渐向高通量测序法(如=Solexa法和SoLiD法等)、芯片杂交法、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridizat1n, ISH)、实时焚光逆转录定量 PCR 法(real-timereverse transcript1n quantitative PCR, RT-qPCR)、恒温扩增检测技术发展。由于miRNA靶分子的上述独特属性，现有的每种检测技术和方法特点各异，各有所长，但也都有明显的缺点，从而使每种方法都有其最适合的使用环境。以目前最常用的基于芯片杂交法的微阵列技术、高通量测序法和RT-qPCR为例。高通量测序与微阵列的检测通量大，并且，高通量测序还可用于发现新miRNA，但是，这两种方法的定量精确性较差，价格昂贵，一般应用于miRNA的初筛研究。此外，高通量测序技术文库制备复杂，达到兆字节(terabytes, TB)的庞大和复杂文库数据分析需要特殊的计算机资源和相关的生物信息学工具和手段，因此，往往由专业的公司提供。由于miRNA的片段小，且Tm值差异大，微阵列技术不能简单地通过增加和减少探针的长度来均衡不同探针的杂交效率，因此，往往需要借助一些特殊的技术手段，例如使用锁核酸探针(lockednucleic acid, LNA)。以茎环引物 RT-qPCR、poly (T)接头 RT-qPCR 为代表的 RT-qPCR 技术是验证基因组水平miRNA表达谱研究结果最常用和最经典的方法，但是该技术均需逆转录步骤，受多种因素制约的实验数据归一化对检测结果精确度影响大，“热变性-复性-延伸”热循环条件需要高纯度的miRNA，此外，扩增效率受到多种因素的影响和制约，易出现非特异性扩增；扩增反应时间长，一般需要几个小时；受限于热动力学特征，无法精确检测2倍以下的表达差异。理想的miRNA检测方法应当具有以下特征:灵敏度高，能够达到检测少量或微量起始材料；特异性好，能够识别仅有单碱基差异的miRNA ;操作简便，无需昂贵的试剂和设备；通用性高，能够应用于miRNA的组织和细胞原位检测、高通量检测、精确定量检测等多个领域。但是，如上所述，受限于miRNA靶分子的特有属性及现有技术的固有局限性，miRNA的现有检测技术往往只能满足上述部分需求。如果能够研发出一种新的能够更好地满足上述需求的技术和方法，一方面，能够得到更广泛的应用，例如，采用一种技术和方法就能实现多个领域的应用，从而有效地拓展非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)的研究深度与广度。恒温扩增技术是温度基本不变的核酸扩增技术。相对于以PCR为代表的变温扩增技术，恒温扩增技术具有以下主要优势:反应温度单一，对设备的要求程度低；不存在温度变化，扩增效率及核酸扩增片段长度均优于常规PCR技术；反应时间短，可在I小时，甚至几分钟内实现靶分子的有效扩增，且灵敏度和特异性与PCR技术相当，甚至更好。上述技术优势使恒温扩增技术在生命科学的各个领域得到了广泛应用，并且，特别适合于miRNA的检测。目前，已经发展出了多种核酸恒温扩增技术，其中，具有代表性的技术主要包括:链置换扩增(strand displacement amplificat1n, SDA)、环介导核酸等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)、滚环扩增(rollingcircle amplificat1n, RCA)、依赖于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-basedamplificat1n, NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(helicase-dependent isothermalDNAamplifixat1n, HAD)、车专录介导扩增(transcript1n-mediated amplificat1n, TMA)、单引物等温扩增(single primer isothermal amplificat1n, SPIA)、信号介导 RNA 扩增技术(signal mediated amplificat1n of RNAtechnology, SMART)、恒温指数扩增(exponential amplificat1n react1n ；EXPAR)。但是，由于miRNA革巴分子的特殊性，仅有部分恒温技术适合于miRNA的检测，例如SDA、RCA和EXPAR。但是，受限于现有恒温技术的技术局限性，现有的miRNA恒温检测技术往往只能检测单一 miRNA靶分子，无法实现多个或高通量miRNA的检测。无论是变温还是恒温扩增技术，DNA聚合酶均是其反应体系的必需酶。一般而言，DNA聚合酶通常具有以下一种或多种生物学功能:5’ 一 3’扩增活性(amplificat1nactivities)、5’ 一3’ 核酸外切酶活性(exonuclease activities)、3’ 一5’ 核酸外切酶活性、链置换活性(strand displacement activities) ο无论是变温还是恒温扩增技术，在引物延伸过程中，当其3’ -延伸末端抵达下游DNA链，即其3’ -延伸末端存在另一条与模板分子互补配对形成的双链DNA (double strandDNA, dsDNA)区域时，如果DNA聚合酶既不具备5’ 一3’外切酶活性，也不具备链置换活性，那么，引物的3’ -末端延伸则受到下游DNA链的阻止而无法继续延伸。但是，当DNA聚合酶具有5’ 一 3’外切酶活性时(如:Taq DNA聚合酶)，该活性可将下游DNA链按照5’ 一 3’方向水解成单核苷酸，从而使引物的延伸得以继续，如实时荧光PCR中的水解探针技术；或本文档来自技高网...

【技术保护点】
微小RNA的液态芯片恒温检测方法，其特征在于：包括反应混合物，反应混合物包括以下反应成分：①具有3'‑端羟基的miRNA靶分子；②上游引物和下游引物；③编码微球；④DNA聚合酶；⑤识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂；⑥三磷酸脱氧核苷酸；⑦满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性的离子与缓冲体系；所述的上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5'→3'碱基均依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区；上游引物和下游引物的锚定序列区与miRNA靶分子无同源性，上游引物、下游引物的识别序列区分别与miRNA靶分子及miRNA靶分子互补链的3'‑端序列互补；所述的上游引物和下游引物具有靶分子特异性，且反应混合物中包括多种靶分子特异性的上游引物和下游引物，每种靶分子特异性的上游引物和/或下游引物通过其5'‑末端固定于编码微球的表面，并且，固定于编码微球表面的上游引物和/或下游引物在其缺口剂识别序列的两侧(即：5'‑端和3'‑端)分别标记具有荧光共振能量转移作用的荧光报告分子和淬灭分子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄庆，府伟灵，黄君富，夏涵，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85