光学显微镜和显微术方法技术

本发明专利技术涉及一种具有样本平面的光学显微镜，待研究的样本能够定位在所述样本平面上，所述光学显微镜具有用于发出照明光线的光源、用于将照明光线导入样本平面中的光学成像器件和探测器装置，所述探测器装置具有多个探测器元件来检测来自样本的样本光线。在此，相邻的探测器元件彼此之间的距离小于样本平面的点在探测器装置上产生的埃里斑。按照本发明专利技术的光学显微镜的特征在于，设有带至少一个第一和第二光学装置的扫描装置，所述扫描装置的光学装置能够同时沿共同的方向运动，以便产生彼此方向相反的照明扫描运动和探测扫描运动，第一和第二光学装置分别具有多个并排布置的光学元件，通过所述光学元件能够同时研究相互间隔的样本区域，第一和第二光学装置布置为，使得从样本平面朝向探测器装置的样本光线的光路以及从光源朝向样本平面的照明光线的光路均经过第一光学装置并且这两条光路中只有一条经过第二光学装置，并且为了实现与照明扫描运动的方向相反的探测扫描运动的方向，能够通过扫描装置使样本光线非倒立地并且以小于1的成像比例成像。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 本专利技术设及一种按照权利要求1的前序部分所述的光学显微镜。本专利技术还设及一 种按照权利要求13的前序部分所述的显微术方法。 按照本专利技术所述类型的光学显微镜具有样本平面，待研究的样本能够定位在所述 样本平面上，所述光学显微镜具有用于发出照明光线的光源、用于将照明光线导入样本平 面中的光学成像器件和探测器装置，所述探测器装置用于检测来自样本的样本光线，其中， 相邻的探测器元件彼此之间的距离小于样本平面中的点在探测器装置上产生的埃里斑。电 子器件可W根据检测到的样本光线确定样本的图像。 在按照本专利技术所述类型的显微术方法中，为了研究定位在光学显微镜的样本平面 上的样本规定，将照明光线导入样本平面内，作为照明扫描运动，使照明光线经过样本平面 并且通过探测器装置检测来自样本的样本光线，所述探测器装置具有多个探测器元件，其 中，相邻的探测器元件彼此之间的距离小于样本平面中的点在探测器装置上产生的埃里 斑。电子器件可W根据检测到的样本光线确定样本的图像。 对于该种来说，基本的目的是一尽可能高的分辨率和良 好的信噪比产生样本图像。 为此，在按照本专利技术所述类型的中使用了探测器元件， 它们小于样本平面中的点在探测器装置上产生的埃里斑。 埃里通过衍射限定的亮斑的旋转对称的光分布的第一零点位置被定义。埃里因此 是成像平面内的衍射小斑的延伸长度，所述衍射小斑由样本平面内的点产生。所述延伸长 度可W定义为衍射小斑的第一零点位置之间的路程。衍射限定的大小为1埃里的光分布具 有0.61A/NA的半径。在此，A是光波长并且NA是数字孔径。 相宜地，相邻的探测器元件之间的距离可W小于埃里斑的二分之一或者S分之 一。样本平面的点由此总是在多个相邻的探测器元件上成像。[000引通过哪些措施能够实现分辨率提高的认知来源于C.Sheppard并且在Co1in Sheppard等的文章"Super-resolutioninConfocalImaging"中描述，出版在Optik 80,No. 2, 45(1988)。在此，为了提高样本图像中的分辨率，在拍摄图像之后，借助特殊的算 法进行再分类和计算，该也称为移动的次埃里探测值的累加。 参照图1阐述该种方法。在图1中示意性地示出了沿样本平面的X轴的样本。所 述样本包括样本点42或者巧光物体42。此外显示了照明点44。所述照明点的强度I显示 在坐标上。照明点44的尺寸是衍射受限的并且在X方向上大于物体42。如果照明点44到 达物体42,则所述物体被激励发巧光并且发出样本光线，所述样本光线可由探测器装置检 测。 在图1中还示出了该种探测器装置60在样本平面中的、在此无限清晰的像。探 测器装置60包括多个探测器元件63、64。所述探测器元件不只接收从样本平面的点发出 的样本光线。在每个探测器元件上还形成延伸的接收区域，其通过像的PSF任ointSpread 化nction，点扩散函数）确定。用于探测器元件64的PSF作为虚线曲线46示出。照明点 44的尺寸同样可W通过点光源的PSF确定。 确定的探测器元件64的测量到的光强度通过总PSF确定，其是关于照明点44的 PSF和关于探测器元件64的PSF46的乘积。总PSF的最大值大约居中地处于相应的探测器 元件64的PSF46和照明点44之间。因此在所示的例子中，探测器元件64主要从居中地处 于照明点44与PSF46之间的位置61A接收光线。而探测器元件64基本上不测量位置61D 的光线，即使在该处对应的PSF46达到其最大值。 为了扫描样本，将照明点从位置44D移动到例如44B。该在此称为照明扫描运动。 探测器元件64的总PSF由此移动。探测器元件64不再主要测量位置61A，而是测量61B。 该可W用于提高分辨率。为此，针对照明点44的每个位置读取探测器元件。在此 测量的样本光信号根据照明点44的位置配置给不同的样本区域。也就是说，由同一个探测 器元件测量的样本光信号根据照明点44的位置被再分类。 所述再分类通过弯曲的箭头显示。因此，如果照明点处于位置44D，则将探测器元 件64的信号配置给物体42的位置61A。类似地，当照明点处于位置44C时，将位置61C处 的探测器元件的信号配置给对象42的位置。当照明点处于位置44B时，将位置61B的信号 配置给对象42的位置。 W此方式可W改善分辨率。然而，为了实现该种再分类，在设备上的耗费较高。此 夕F，用于计算再分类所需的时间相对较长。 分辨率的改善也可W被描述为单点系统的光学传递光谱中的更高空间频率的更 大的加权。因为为了成像使用1埃里小孔直径内的光分布，所W能够检测到更多光子。由 此改善了信噪比。 利用具有亚埃里分辨率的探测器装置的可比照的显微镜在EP2 520 965A1和 化rk等人的化化reMethodsVol. 9, 749-754(2012)中描述。此外利用多点照明。在此，每 个光点或者光斑依次经过不同的样本区域进行扫描。然而在扫描中，需要针对不同的扫描 位置分别读取由探测器装置拍摄的图像并且如前所述地计算，例如参见York等人的文章 "SupplementaryNote1"。由此降低了图像拍摄速度，该尤其对于活体细胞的成像是不利 的。此外，可能在图像中形成计算和/或运动假象。 为了W提高的分辨率研究样本，还设置了具有结构化照明（SIM)的显微镜。在此， 结构化的照明可W例如通过线条栅格产生。 在激光扫描显微镜（LSM)中，使用照明点作为结构化照明。在此，通过共焦的成 像实现提高的分辨率，为此将小孔，也就是孔光圈定位在图像平面之内或之上。然而在LSM 中，信噪比相对较低，因为只利用了相对较少的一部分光。 为了同时研究多个样本区域，可W使用具有巧普科夫盘的显微镜。所述巧普 科夫盘包括多个布置为阿基米德螺旋线的小孔。该种显微镜在US5, 428, 475A和US 2008/0218849A1 中描述。 通过将巧普科夫盘布置在共同的照明和探测光路中，过滤掉了焦点之外的光。利 用该种相对简单的结构通过旋转巧普科夫盘可W实现迅速的图像拍摄。因此，巧普科夫盘 也称为旋流片。巧普科夫盘的多个小孔的同时照明，即所谓的多点研究，可W进一步加快样 本研究的速度。具有该种结构的显微镜在EP1 359 452A1中描述。为了将更大部分的照 明光线引导通过巧普科夫盘的小孔，在此使用微型对焦透镜盘。它与巧普科夫盘共同旋转。 样本光线同样被引导穿过该微型对焦透镜盘并且接着通过另一微型对焦透镜盘朝探测器 的方向引导。 在该些已知的旋流片显微镜中，只能W较差的信噪比达到光学极限分辨率的范 围。 本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种光学显微镜和一种显微术方法，其中 能够在较短的测量时间内W成本低廉的方式实现尽可能高的测量分辨率。 该技术问题按本专利技术通过一种具有权利要求1所述特征的光学显微镜和一种具 有权利要求13所述特征的显微术方法解决。 按照本专利技术的方法和按照本专利技术的光学显微镜的优选实施变型方案是从属权利 要求的
技术实现思路
并且尤其结合附图在W下的说明书中阐述。 上述类型的光学显微镜按照本专利技术的特征在于，设有带至少一个第一和第二光学 装置的扫描装置。所述扫描装置的光学装置能够同时沿共同的方向运动，W便产生彼此方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光学显微镜，具有样本平面(40)，待研究的样本(41)能够定位在所述样本平面上，具有用于发出照明光线(15)的光源(10)，具有用于将照明光线(15)导入样本平面(40)中的光学成像器件(16、17、20、21、30)并且具有探测器装置(60)，所述探测器装置具有多个探测器元件(61‑64)来检测来自样本(41)的样本光线(45)，其中，相邻的探测器元件(63、64)彼此之间的距离小于样本平面(40)的点在探测器装置(60)上产生的埃里斑，其特征在于，设有带至少一个第一和第二光学装置(51、52)的扫描装置(50)，所述扫描装置(50)的光学装置(51、52)能够同时沿共同的方向运动，以便产生彼此方向相反的照明扫描运动(81)和探测扫描运动(82)，其中，照明扫描运动(81)是照明光线(15)在样本平面(40)上的扫描运动并且其中，作为探测扫描运动(82)，探测器元件(61‑64)的接收区域能够在样本平面(40)上运动，第一和第二光学装置(51、52)分别具有多个并排布置的光学元件(71、72)，通过所述光学元件能够同时研究相互间隔的样本区域，第一和第二光学装置(51、52)布置为，使得从样本平面(40)照向探测器装置(60)的样本光线(45)的光路以及从光源(10)照向样本平面(40)的照明光线(15)的光路均经过第一光学装置(51)并且这两条光路中只有一条经过第二光学装置(52)，并且为了实现与照明扫描运动(81)的方向相反的探测扫描运动(82)的方向，能够通过扫描装置(50)使样本光线(45)非倒立地并且以小于1的成像比例成像。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：W巴思，R内茨，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE