本发明专利技术提供同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗、编码该疫苗抗原的核苷酸序列以及该疫苗的制备方法和应用。该疫苗抗原的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.4所示。该疫苗的制备方法具体为根据新孢子虫AMA1基因序列和弓形虫AMA1基因序列的开放阅读框，设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因的通用引物，构建pMD18-T-Nc/TgAMA1重组克隆质粒、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-Nc/TgAMA1及表达质粒H294-Nc/TgAMA1，脂质体介导转染QBI-HEK293细胞包装Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒，扩增、纯化制备Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒载体疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及寄生虫病疫苗基因工程
，提供一种同时预防新孢子虫和弓形 虫感染的疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
新孢子虫病和弓形虫病是严重危害养殖业健康发展和人类身心健康的主要寄生 虫病，目前尚无有效的药物和疫苗防控。 新孢子虫病是由犬新孢子虫（Neospora caninum)寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动 物细胞内而引起的一种原虫病，该病主要引起母畜流产、死胎或新生儿运动障碍和神经系 统疾病。犬是新孢子虫的终末宿主，多种哺乳动物都可以作为中间宿主，它的寄生部位是中 枢神经系统、脑、肝、肌肉及其它内脏组织。国外对新孢子虫的研宄已取得了一定进展，而国 内对新孢子虫的研宄尚属起步阶段。 弓形虫病是由刚地弓形虫（Toxophasma gondii)引起的人畜共患病。该病多呈隐 性感染，主要侵犯眼、脑、心、肝、淋巴结等，虫体可通过胎盘感染胎儿，引起孕畜早产、流产、 畸形胎等，严重危害人类及养殖业的健康发展。 新孢子虫与弓形虫是亲缘关系相近的细胞内寄生性原虫，二者在形态结构、分子 生物学特征以及发病的临床症状和病理变化等方面都很相似。AMl顶端膜抗原定位于微线 体，是新孢子虫和弓形虫的速殖子期和缓殖子期表达蛋白，与虫体侵入宿主细胞和自身复 制的功能密切相关。AMl是新孢子虫和弓形虫一个潜在的共同候选疫苗抗原，可用来控制 新孢子虫和弓形虫的入侵。 对于新孢子虫疫苗的研宄大多采用传统方法，如利用新孢子虫表面抗原蛋白基因 制备重组蛋白亚单位疫苗，或利用真核表达载体制备核酸疫苗等，而制备的亚单位疫苗或 核酸疫苗均存在免疫效果不佳、保护率低下等问题，尚不能用于新孢子虫病的有效防控； 而对弓形虫疫苗的研宄虽然取得了一定进展，但疫苗的免疫效果也均不理想。并且，国内外 尚无同时预防新孢子虫和弓形虫疫苗的问世，也未见同时预防新孢子虫和弓形虫重组腺病 毒载体疫苗的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是鉴于现有技术中存在的上述问题而做出的，其目的是提供一种能够同时 预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗，该疫苗为重组腺病毒载体疫苗，可用于同时预防新孢 子虫和弓形虫的感染。 本专利技术的另一目的是提供一种编码上述疫苗抗原的核苷酸序列。 本专利技术的再一目的是提供一种上述疫苗的制备方法。 本专利技术的又一目的是提供抗原的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2及SEQ. ID. NO. 4在制 备用于预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗中用途。 为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下： -种同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗，该疫苗抗原的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2 及 SEQ. ID. NO. 4 所示。 进一步地，所述疫苗抗原通过腺病毒载体进行表达。 进一步地，所述腺病毒载体为 pCR259、HighQ-lTranspose-Ad?294 和 HighQ-l?。 -种编码上述疫苗抗原的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1及SEQ. ID. NO. 3 所示。 -种制备同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗的方法，包括： a.引物设计，根据新孢子虫（AB265823. DAMAl基因序列和弓形虫（AF010264. 1) AMl基因序列的开放阅读框，设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMl基因的通用引物P1、 P2,所述引物P1、P2为： Pl :5, -CCGCTCGAGGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGAGTA-3' P2 :5' -CTAGTCTAGATTAAGAATCCGAAACCAGGCA-3' ； b.扩增与克隆，分别以新孢子虫基因组DNA和弓形虫基因组DNA为模板，以Pl和 P2为引物，对AMAl基因进行PCR扩增，将PCR扩增产物克隆于pMD18-T Simple Vector得 到pMD18-T-Nc/TgAMAl重组克隆质粒，进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析； c.亚克隆，将Nc/Tg AMAl基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体，构建重组腺病毒 穿梭质粒 pCR259-Nc/Tg AMAl ; d.转化，依次转化HighQ-lTranspose-Ad?294和HighQ-l?感受态细胞，构建重组 腺病毒表达质粒H294-Nc/Tg AMAl ; e.转染，采用脂质体介导转染法转染QBI-HEK293细胞包装重组腺病毒Ad5-Nc/ TgAMAl，检测AMl基因在QBI-HEK293细胞中的表达；以及 f.疫苗制备，扩增，纯化以制备所述疫苗。 进一步地，所述新孢子虫的扩增基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，所述弓 形虫的扩增基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。 进一步地，所述PCR扩增的反应体系为25 μ L :10 X Buffer 2. 5 μ L、dNTP2 μ L、上 下游引物各1 μ L、模板DNA 2 μ UTaq酶0. 25 μ L以及灭菌去离子水16. 25 μ L ;所述PCR扩 增的反应条件为：95°C预变性5min，94°C变性45s，58°C退火45s，72°C延伸7min，4°C保存。 进一步地，所述引物Pl含有XhoI酶切位点，所述引物P2含有XbaI酶切位点。 本专利技术的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗的制备方法，根据新孢子虫 (AB265823. DAMAl基因序列和弓形虫（AF010264. DAMAl基因序列的开放阅读框，设计新 孢子虫和弓形虫交叉抗原AMl基因的通用引物，构建pMD18-T-Nc/TgAMAl重组克隆质粒、 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-Nc/TgAMAl及表达质粒H294-Nc/TgAMAl，脂质体介导转染至 QBI-HEK293细胞包装Ad5-Nc/TgAMAl重组腺病毒，测定病毒滴度后扩增、纯化制备Ad5-Nc/ Tg AMl重组腺病毒载体疫苗。 本专利技术的疫苗能够诱导免疫动物产生强烈的免疫应答反应，可应用于同时预防新 孢子虫和弓形虫的感染，该疫苗还可应用于用于同时预防新孢子虫和弓形虫的感染的药剂 中。抗原的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2及SEQ. ID. NO. 4可应用于制备用于预防新孢子虫和 弓形虫感染的疫苗中。 有益效果 本专利技术的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的重组腺病毒载体疫苗，经动物免疫试 验和攻虫试验证实，能够诱导免疫动物产生强烈的免疫应答反应，对新孢子虫和弓形虫攻 击具有良好免疫保护作用，从而可以达到同时预防新孢子虫和弓形虫的目的。 本专利技术应用的腺病毒载体转基因效率高，可以有效地将外源基因表达成具有活性 的蛋白；可转导不同类型的组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度 病毒载体；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。【附图说明】 为使本专利技术的【具体实施方式】的描述更加清楚，下面对【具体实施方式】中使用的附图 进行说明。 图1为新孢子虫AMl基因和弓形虫AMl基因的PCR扩增产物的电泳图，其中，M 泳道代表DL2000DNA marker，1泳道代表PCR扩增新孢子虫产物；2泳道代表PCR扩增弓形 虫产物；3泳道代表PCR扩增水对照。 图2为包装重组腺病毒Ad5-Nc/TgAMAl的QBI-HEK293细胞图。 图3为攻击新本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗，其特征在于，该疫苗抗原的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾立军，刘明明，张蕾，李积旭，张守发，玄学南，
申请(专利权)人：延边大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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