自组织化重组透明颤菌血红蛋白及其基因和应用制造技术

一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白及其基因在基因工程产品生产中的应用，属于基因工程技术领域。是由透明颤菌血红蛋白模块、连接肽模块和自组织化模块组成；透明颤菌血红蛋白模块的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；连接肽模块的氨基酸序列为(SEQ ID NO.2)n，n值是连接肽模块的串联重复次数，n＝2～10的整数；自组织化模块的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。本发明专利技术公开基因所表达的蛋白与透明颤菌蛋白相比具有自组织化能力，自组织化的重组透明颤菌血红蛋白具有更高的质膜结合性质，可以在环境溶氧不足情况下提高宿主细胞的生物量和提高宿主细胞的基因工程产品产量，降低成产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种具有自组织化能力的重组透明颤菌 血红蛋白及其基因在基因工程产品生产中的应用。
技术介绍
随着细胞生物学以及生物工程技术在微生物、植物、动物领域的应用，利用基因工 程技术已经可以生产、改良甚至构建具有目的功能或者生产目的基因工程产品，基因工程 产品的生产已经取得了巨大的成功。 基因工程技术结合对宿主细胞代谢合成途径的认知，利用基因工程技术可以实现 宿主生物质促进生产、目的基因工程产品促进生产、目的次级代谢产物促进生产。 在基因工程产品生产中，通过基因工程技术将目的基因与载体在体外连接后转入 受体宿主细胞，使外源基因在宿主细胞中稳定表达并遗传。 以抗生素等次级代谢产物为代表的基因工程产品在生产过程往往受到氧供给的 限制，氧需要通过溶解、传递等环节才能被宿主细胞利用，氧自身在水溶液中的溶解度有 限，为提高氧的供给能力，需要通过增加通气量、加快搅拌速度等办法来增加溶氧，这使得 基因工程产品生产成为高能耗产业。随基因工程技术的发展，利用基因工程技术改良宿主 氧获得能力，降低基因工程产品生产能耗，提高基因工程产品产量成为可能。目前，VHb已 经应用于发酵、重组蛋白表达、次级代谢产品表达、转基因动物、转基因植物和环保领域，取 得了显著成效。 透明颤菌血红蛋白（vitroeoscilla hemoglobin, VHb)是目前研宄较为深入的原 核生物血红蛋白，VHb是由两个相同亚基构成的同型二聚体蛋白，每个亚基含有146个氨基 酸残基和一个b型血红素分子。VHb具有很强的氧结合能力和非常迅速的氧释放能力，在基 因工程产品生产中往往作为辅助蛋白使用，提高宿主菌的氧俘获能力。 在氧浓度较低（溶氧低于5%大气饱和度）的情况下，VHb受到其天然启动子的诱 导表达，研宄表明，当VHb在宿主细胞中表达时，宿主细胞的tRNAs和核糖体含量有所提高， 宿主细胞的呼吸活性和ATP含量也有所增加。Khosla等（Nature, 1988, 331，633-635)提 出，在低氧条件下，VHb血红蛋白能够大量积累，一部分VHb以活性的氧合蛋白形式存在，加 速氧在低氧条件下向胞内传递，构造一个有机体可直接利用的蓄氧仓库，氧合血红蛋白能 提高氧在呼吸链上的传递效率，加快了质子传递，促进了 ATP的合成，提高了整个能量代谢 水平。 Ramande印（J. Biol. Chem. 2001，276, 24781 - 24789)研宄表明 VHb 在大肠杆菌中 表达时存在质膜结合和胞质表达两种模式，Rinaldi指出质膜结合形式的VHb起到氧俘获 功能（Biochemistry 2006, 45, 4069-4076)，Anand指出胞质表达VHb起到氧感受器的功能， 感受宿主细胞内的氧化压力，当宿主细胞内氧化压力增加时抑制VHb蛋白的表达（Biochem J. 2010, 426, 271-280)。相比而言，质膜结合型的VHb对宿主细胞的氧供给能力有着更为重 要的作用。 为提高VHb对宿主细胞的促进效果，对VHb的密码子偏好性改造、定点突变、 易错PCR(error-prone PCR)改造、DNA改组（DNA shuffling)改造已经广泛展开，这些 工作的进行进一步加深了对VHb生物工程和结构关系的理解，I sarankura-Na-Ayudhya 指出对VHb自身结构的改造会引发该蛋白功能的较大变化（J microbiol biotechnol 2010, 20, 532-541 ;J.Biosci. Bioeng. 2010，110, 633-637 ;Int J biol Sci. 2008, 4, 71-80)。 这种情况下，在保留VHb自身结构稳定的前提下，在VHb功能结构域之外引入自组 织化多肽序列构建新的重组蛋白，利用自组织化片段间的相互识别和相互作用，改变重组 蛋白的组装和宿主细胞内的分布形式，进而影响宿主的氧俘获和氧储存能力就成为一种新 的VHb蛋白结构改造方法。自组织化是蛋白质的一种特殊的组装方式，自组织化是通过多肽序列间直接的弱 相互作用进行识别和组装的，自组织化后的蛋白质自组装体呈现出较强的质膜结合能力。 自组织化多肽序列可以通过基因工程技术拼接到不同的重组蛋白内，诱导重组蛋白实现自 组织化。至今未见利用自组织化片段重组技术，改进重组透明颤菌血红蛋白的质膜结合能 力的研宄
技术实现思路
为提高宿主细胞中质膜结合型VHb含量，本专利技术提供一种具有自组织化能力的重 组透明颤菌血红蛋白，该蛋白在宿主细胞内依据自身结构和蛋白质的理化性质，提高质膜 结合型VHb含量，增加宿主细胞从环境中获得氧的能力，改善宿主细胞的氧俘获能力。 本专利技术所述的自组织化重组透明颤菌血红蛋白是以连接肽模块连接透明颤菌血 红蛋白模块和自组织化模块；自组织化模块诱导重组蛋白在宿主细胞内形成自组装体，自 组装体蛋白依据其自身的质膜结合能力与宿主细胞质膜进行结合，透明颤菌血红蛋白模块 在宿主细胞质膜附近起到从宿主细胞生存环境中俘获氧的功能。本专利技术可以用于改进宿主 细胞从环境中获得氧的能力，有助于促进基因工程产品的表达，降低基因工程产品生产的 能耗（实施例1中有体现（图10)，相同转速条件下，含有自组织化重组透明颤菌血红蛋白 的宿主细胞发酵液中溶氧值高于阴性对照组（仅表达GFPuv的宿主细胞），在停止外界供氧 的条件下，含有自组织化重组透明颤菌血红蛋白的宿主细胞的发酵液中氧浓度降低缓慢， 而阴性对照组氧迅速的消耗殆尽，这说明我们的基因产物自组织化透明颤菌血红蛋白可以 实现氧储存和氧缓释，有效的缓解发酵液发酵罐中的氧不足，一般说来，只要降低了发酵过 程中向发酵液（罐）中补充氧或者空气的量（频率），或者提高了发酵液中细胞环境的溶氧 度，就会降低基因工程产品生产的能耗，为了保持发酵过程中发酵液中细胞周围的氧浓度， 向发酵罐中补充氧气或者空气的能耗很高）。 与
技术介绍
相比： 1)利用连接肽模块分割了自组织化模块与透明颤菌血红蛋白模块，连接肽模块的 存在，保证了重组蛋白中各个功能模块在蛋白质折叠过程中以自身固有的折叠及组装规律 进行二级、三级结构的实现，以单独的结构域存在在多模块重组蛋白中，连接肽模块在不影 响透明颤菌血红蛋白氧结合-释放能力的前提下，赋予重组蛋白自组织化功能； 2)利用透明颤菌血红蛋白模块实现重组透明颤菌血红蛋白的氧结合和释放功能， 保留了对透明颤菌血红蛋白进行进一步的密码子代换、突变、易错PCR改进和DNA重组改进 的可能，即该重组蛋白保留了随技术进步再次进行优化和改造的能力； 3)利用自组织化模块实现了重组透明颤菌血红蛋白在宿主细胞内的自组织化和 质膜结合定位，改进了宿主细胞的氧俘获功能。 4)自组织化重组透明颤菌血红蛋白基因在透明颤菌血红蛋白基因自身的厌氧启 动子控制下，可以通过本领域中为人所熟知的知识和技术引入不同的基因载体和宿主细胞 中，进行基因工程产品的生产。 如图1所示，本专利技术所述的自组织化重组透明颤菌血红蛋白是由透明颤菌血红蛋 白模块、连接肽模块和自组织化模块组成，其中连接肽模块数目可有操作人员依据具体需 求进行灵活调整；自组织化模块分为强质膜结合（膜破坏）模块和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白，其特征在于：是由透明颤菌血红蛋白模块、连接肽模块和自组织化模块组成；透明颤菌血红蛋白模块的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；连接肽模块的氨基酸序列为(SEQ ID NO.2)n，n值是连接肽模块的串联重复次数，n＝2～10的整数；自组织化模块的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕明，杨少林，吴家安，周杰，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22